Spezifische Signaltransduktionswege, über die das E1A-Onkoprotein und alkylierende Substanzen die Expression zellulärer Gene modulieren:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Karlsruhe
FZKA
1997
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Forschungszentrum <Karlsruhe>: Wissenschaftliche Berichte
5886, B |
| Schlagworte: | |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen 1
Einleitung 3
Material 17
Methoden 25
1. Zellkultur 25
Passagieren von Zellen
Einfrieren und Auf lauen von Zellen
Behandlung von Zellen mit Induktoren
Kalziumphosphat-Transfektion von Zellen
Metabolische Markierung von Proteinen mit 35S -Methionin
Präparation von Zellen ohne Kern (Zytoplasten)
2. Analyse von Nukleinsäuren 28
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Phenol/Chloroform-Extraktion
Fällung von Nukleinsäuren
3. DNA-Methoden 29
3.1 DNA-Präparation 29
Plasmid-DNA Mini-Präparation
Plasmid-DNA Maxi-Präparation
3.2 Klonierungstechniken 31
Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Dephosphorylierung von DNA
Phosphorylierung von Oligonukleotiden und Linkem
Auffüllen von 5 -Überhängen
Ligation von DNA-Fragmenten
Polymerase-Ketten-Reaktion
Sequenzierung von DNA
Herstellung kompetenter E. coli Bakterien
Transformation kompetenter Bakterien
3.3 DNA-Gelelektrophorese 34
Agarose-Gelelektrophorese
Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Denaturierende Polyacrylamid-Hamstoff-Gele
4. RNA-Methoden 36
Präparation von Gesamt-RNA
RNase Protektionsanalyse
5. Protein-Methoden 37
Bestimmung der Proteinkonzentration nach Lowry
Auftrennung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen
Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung von Proteinen
Immunoblot-Analyse von Proteinen ( Western Blot )
Immunpräzipitation von Proteinen
Bestimmung der Chloramphenicol-Azetyltransferase-Aktivität ( CAT-Assay )
Produktion und Reinigung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen
Herstellung der Na3VO4-Stammlösung
In-Gel-Kinase-Assay
Reinigung der cJun- bzw. ATF-2-assoziierten Kinasen
Immunkomplex-Kinase-Assay
Ergebnisse 47
Teil I: ElA-induzierte Signaltransduktion 47
Endogenes cJun wird durch TPA und El A induziert
El A aktiviert JNK/SAPKs und p38-MAP-Kinase
EIA-Expression aktiviert SEK1
Klonierung von Östrogen-induzierbarer EIA-Expressionsvektoren
ER-Fusionsproteine reprimieren die TPA-Induktion der Kollagenase
Stabile Transfektion der El A-ER-Konstrukte
In den Zeilklonen G6ER und F16ER läßt sich keine Östrogen-abhängige
JNK/SAPK-Aktivierung feststellen
Teil II: MMS-induzierte Signaltransduktion 69
MMS aktiviert JNK/SAPKs
JNK/SAPKs phosphorylieren ebenfalls ATF-2
Die JNK/SAPK-Aktivierung durch MMS ist konzentrationsabhängig
JNK/SAPKs werden nur von bestimmten alkylierenden Substanzen aktiviert
MMS induziert Proteinkinasen-Kaskaden
Die MMS-Antwort ist unabhängig von Signalen aus dem Kern
An der MMS-Antwort sind keine Zelloberflächen-Rezeptoren beteiligt
Die MMS-Antwort wird durch Glutathion und N-Acetylcystein gehemmt
Diskussion 91
Literatur 107
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