Gentherapeutische Strategien bei Hämophilie: Untersuchungen zu aktuellen methodischen Problemen
Gespeichert in:
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| Format: | Mikrofilm Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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| Ausgabe: | [Mikrofiche-Ausg.] |
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Bonn, Univ., Diss., 1997. - Mikrofiche-Ausg.: 2 Mikrofiches : 24x |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 BLUTGERINNUNGSSYSTEM UND HAEMOPHILIE 1
1.1.1 DAS B LUTGERINNUNGSSYSTEM 2
1.1.2 DIE HAEMOPHILIE A 4
1.1.2.1 KLINIK 4
1.1.2.2 MOLEKULARBIOLOGIE DES FAKTOR VIII 5
1.1.3 DIE HAEMOPHILIE B 11
1.1.3.1 KLINIK 11
1.1.3.2 DIE MOLEKULARBIOLOGIE DES FAKTOR IX 11
1.1.4 THERAPIE DER HAEMOPHILIE 13
1.2 GENTHERAPIE 14
1.2.1 EX VIVO ANSATZ 16
1.2.2 IN VIVO ANSATZ 16
1.2.3 ADENOVIRALE VEKTORSYSTEM 17
1.2.4 GENTHERAPIEANSAETZE FUER DIE HAEMOPHILIEBEHANDLUNG 20
1.3 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT 22
2. MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 MATERIAL 25
2.1.1 CHEMIKALIEN 25
2.1.2 LOESUNGEN, PUFFER, NAEHRMEDIEN, GELE UND ZELLEN 27
2.1.3 OLIGONUKLEOTIDE 31
2.2 METHODEN 33
2.2.1 GELELEKTROPHORESE 33
2.2.1.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 33
2.2.1.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 33
2.2.2 DNA- UND RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN 34
2.2.3 KLONIERUNG IN E.COLI KL2 34
2.2.3.1 ISOLATION VON PLASMID-DNA 34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3.2 ENZYMATISCHE SPALTUNG VON DNA MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 35
2.2.3.3 LIGATION 35
2.2.3.4 TRANSFORMATION 36
2.2.3.5 SELEKTION UND AMPLIFIKATION VON BAKTERIENKLONEN 36
2.2.3.6 LAGERUNG 37
2.2.3.7 KONSTRUKTION DER VERKUERZTEN FVIII-CDNA 37
2.2.4 AMPLIFIKATION SPEZIFISCHER DNA DURCH DIE
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 37
2.2.4.1 PCR-REAKTIONSANSATZ 38
2.2.4.2 REAKTIONSBEDINGUNGEN 38
2.2.5 RNA-ISOLIERUNG 39
2.2.5.1 RNA-ISOLATION AUS MAUSORGANEN 39
2.2.5.2 RNA-ISOLATION AUS ZELLKULTURZELLEN 40
2.2.6 REVERSE TRANSKRIPTION 40
2.2.7 RNA-QUANTIFIZIERUNG MITTELS KOMPETITIVER RT-PCR 41
2.2.7.1 MUTAGENESE DES STANDARDS 42
2.2.7.2 IN VITRO RNA-TRANSKRIPTION 42
2.2.7.3 REVERSE TRANSKRIPTION UND KOMPETITIVE PCR 43
2.2.7.4 AUSWERTUNG 43
2.2.8 NORTHEM-BLOT 44
2.2.8.1 RNA-GELELEKTROPHORESE 44
2.2.8.2 KAPILLARBLOT 44
2.2.8.3 PRAEHYBRIDISIERUNG UND HYBRIDISIERUNG DER MEMBRAN 45
2.2.8.4 DETEKTION 45
2.2.9 AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG PCR-AMPLIFIZIERTER DNA 45
2.2.9.1 SEQUENZIERREAKTION MIT AMPLITAQ DNA POLYMERASE, FS 46
2.2.9.2 AUFTRENNUNG DER SEQUENZIERTEN FRAGMENTE DURCH
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND AUSWERTUNG 47
2.2.10 ZELLKULTUR 47
2.2.11 LIPOFEKTION 48
2.2.12 SS-GAL FAERBUNG 48
2.2.13 EXPRESSIONSSTUDIEN 49
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.14 IMMUNPRAEZIPITATION 49
2.2.15 WESTERNBLOT 50
2.2.15.1 PROTEIN-GELELEKTROPHORESE 50
2.2.15.2 ELEKTRO-BLOT 50
2.2.15.3 ANTIKOERPERINKUBATION UND DETEKTION 50
2.2.16 HERSTELLUNG REPLIKATIONSDEFIZIENTER, REKOMBINANTER ADENOVIREN 51
2.2.16.1 CALCIUMPHOSPHAT-COTRANSFEKTION 51
2.2.16.2 ISOLATION DER VIRALEN UND CHROMOSOMALEN DNA
AUS 293-ZELLEN 52
2.2.16.3 PLAQUE-ASSAY 52
2.2.16.4 VIRUSPRAEPARATION 53
2.2.16.5 IN VITRO INFEKTION VON ZELLEN MIT DEM REKOMBINANTEN
GFP-ADENOVEKTOR 54
2.2.17 ELISA 54
2.2.17.1 FVIII-ANTIGEN-ELISA 54
2.2.17.2 VWF-BINDUNGS-STUDIEN 56
2.2.18 FVIII-AKTIVITAET 59
2.2.18.1 CHROMOGENER FVIII-AKTIVITAETSTEST 59
2.2.18.2 MECHANISCHE FVIII-AKTIVITAETSBESTIMMUNG 60
3. ERGEBNISSE 61
3.1 MRNA-QUANTIFIZIERUNG IN FAKTOR IX-TRANSGENEN MAEUSEN IN VIVO 61
3.2 VERGLEICHENDE EXPRESSIONSSTUDIEN ZWISCHEN DEM KOMPLETTEN UND
EINEM B-DOMAENEN VEKUERZTEN FVIII-PROTEIN 68
3.2.1 KONSTRUKTION DER B-DOMAENEN VERKUERZTEN FVIII-CDNA 68
3.2.2 PROTEINSTRUKTUR DES VERKUERZTEN FVIII-PROTEINS 70
3.2.3 VERGLEICHENDE EXPRESSION DES FVIII/WT- UND DES
FVIII/AB-PROTEINS IN ZELLKULTUR 71
3.2.3.1 FVIII-ANTIGEN-EXPRESSIONSKINETIK 74
3.2.3.2 SPEZIFISCHE FVIII-AKTIVITAET 83
3.2.3.3 VWF-BINDUNGS-STUDIE 88
3.3 KONSTRUKTION REPLIKATIONSDEFIZIENTER, REKOMBINANTER ADENOVIREN 91
3.3.1 REKOMBINANTER ADENOVEKTOR FUER GFP 91
_INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2 REKOMBINANTER ADENOVEKTOR FUER HFVIII 100
4. DISKUSSION 101
4.1 EINLEITUNG 101
4.2 QUANTIFIZIERUNG TRANSGENER FIX-MRNA NACH GENTRANSFER IN VIVO 102
4.3 VERGLEICHENDE ZELLBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN VON FVIII/WT
UND FVIII/AB 107
4.3.1 DER FVIII/AB 107
4.3.2 VERGLEICHENDE EXPRESSIONSSTUDIEN 109
4.3.2.1 UNTERSCHIEDE IN DER EXPRESSIONSKINETIK DES FVIII/WT
UND DES FVIII/AB 109
4.3.2.2 UNTERSCHIEDE IN DER EXPRESSIONSKINETIK UND DER
SPEZIFISCHEN AKTIVITAET DER REKOMBINANTEN FVIII-
PROTEINE ZWISCHEN DEN ZELLEN 111
4.4 KONSTRUKTION REPLIKATIONSDEFIZIENTER, REKOMBINANTER ADENOVIREN 116
4.4.1 DER REKOMBINANTE GFP-ADENOVEKTOR 116
4.4.2 KONSTRUKTION VON REKOMBINANTEN HFVIII-ADENOVIREN 118
4.5 RUECKBLICK UND AUSBLICK 119
5. ZUSAMMENFASSUNG 124
6. LITERATURVERZEICHNIS 126
ANHANG 137
DANKSAGUNG 139
LEBENSLAUF 140 |
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