Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen 1,4-Benzodiazepine zum empfindlichen Nachweis in biologischem Probenmaterial:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Erlangen-Nürnberg, Univ., Diss., 1997 |
| Beschreibung: | VII, 122 S. graph. Darst. |
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HERSTELLUNG MONOKLONALER UND POLYKLONALER ANTIKOERPER
GEGEN 1,4-BENZODIAZEPINE ZUM EMPFINDLICHEN NACHWEIS IN BIOLOGISCHEM
PROBENMATERIAL
DEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAETEN DER
FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET ERLANGEN-NORNBERG
ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES
VORGELEGT VON
INGRID ACKERMANN
AUS WEISSENSTADT
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG L
2. ALLGEMEINER TEIL 4
2.1 STAND DER TECHNIK 4
2.1.1 IMMUNOLOGISCHE NACHWEISVERFAHREN AUF DEM GEBIET DER
BENZODIAZEPINANALYTIK 4
2.1.2 IMMUNADSORPTION IN DER TOXIKOLOGISCHEN ANALYTIK, IM
VETERINAERMEDIZINISCHEN BEREICH SOWIE IN DER DOPINGKONTROLLE 6
2.2 STANDARDMETHODIK. 7
2.2.1 EIGENSCHAFTEN VONLMMUNGLOBULINEN 7
2.2.2 IMMUNOASSAYS 9
2.2.2.1 PRINZIP EINER TITERBESTIMMUNG (ELISA) 10
2.2.2.2 PRINZIP DES SCREENING-ELISA 11
2.2.2.3 PRINZIP DES KOMPETITIONS-ELISA 11
2.2.3 HERSTELLUNG POLYKLONALER UND MONOKLONALER ANTIKOERPER 12
2.2.3.1 HERSTELLUNG VON IMMUNOGENEN 12
2.2.3.2 AUSLOESEN EINER IMMUNANTWORT 13
2.2.3.3 AUSWAHL DER TIERE 14
2.2.3.4 GEWINNUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 15
2.2.3.5 GEWINNUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 15
2.2.3.5.1 KULTIVIERUNG DER MYELOMAZELLEN 16
2.2.3.5.2 BLUTENTNAHME UND TITERBESTIMMUNG 16
2.2.3.5.3 MILZENTNAHME, ZELLFUSION UND SELEKTIONSPRINZIP 16
2.2.3.5.4 AUSWAHL ANTIKOERPER-PRODUZIERENDERZELLKLONE
MITTELS ELISA UND VEREINZELUNG (KLONIERUNG) 17
2.2.3.5.5 KULTIVIERUNG VON HYBRIDOMEN 18
2.2.4 ISOLIERUNG VON ANTIKOERPERN 18
2.2.4.1 CHARAKTERISIERUNG VON ANTIKOERPERN ANHAND
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGEL- ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 19
IMAGE 3
2.2.5 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE UND IMMUNADSORPTION 20
2.2.5.1 PRINZIP EINER IMMOBILISIERUNG VON PROTEIN AN
GLUTARDIALDEHYD-AKTIVIERTES AMINOSPHEROSIL 21
2.2.5.2 PRINZIP EINER IMMOBILISIERUNG VON PROTEIN AN CNBR- . AKTIVIERTE
AGAROSE 21
3. EXPERIMENTELLER TEIL 23
3.1 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN GEGEN BENZODIAZEPINE 23
3.1.1 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER. 23
3.1.1.1 HERSTELLUNG VON OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY- KLH SOWIE
OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-OVA 24
3.1.1.1.1 HERSTELLUNG VON OXAZEPAM-3-HEMISUCCINAT 24
3.1.1.1.1.1 CHARAKTERISIERUNG DES REAKTIONSPRODUKTES 25
3.1.1.1.2 HERSTELLUNG VON OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY- KLH UND
OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-OVA 28
3.1.1.1.2.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES GEBUNDENEN
OXAZEPAM-3-HEMISUCCINAT IN OXAZEPAM-3- HEMISUCCINYLOXY-KLH UND
OXAZEPAM-3- HEMISUCCINYLOXY-OVA (HPLC) ; 29
3.1.1.1.3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 30
3.1.1.2 ENTWICKLUNG EINES IMMUNOASSAYS (ELISA) ZUM
NACHWEIS VON ANTIKOERPERN GEGEN
BENZODIAZEPINE 31
3.1.1.2.1 TEST VON VIER ANTIGENEN AUF UNSPEZIFISCHE BINDUNG
IM ELISA ... 31
3.1.1.2.2 UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE 32
3.1.1.3 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN UND GEWINNUNG
MONOKLONALER ANTIKOERPER 33
3.1.1.3.1 IMMUNISIERUNGEN UND TITERBESTIMMUNG 33
3.1.1.3.2 HERSTELLUNG VON HYBRIDOMEN 33
3.1.1.3.2.1 ZELLFUSIONIERUNG UND KLONIERUNGEN DER ANTIKOERPER-
PRODUZIERENDEN ZELLINIEN 33
3.1.1.3.2.2 PRODUKTION MONOKLONALER ANTIKOERPER IN
SUSPENSIONSKULTUREN SOWIE IM MINIPERM- BIOREAKTORSYSTEM 36
3.1.1.3.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER.... 37
III
3.1.1.3.2.3.1 ERMITTLUNG DER KREUZREAKTIVITAETEN DER
MONOKLONALEN ANTIKOERPER (KOMPETITIONS-ELISA) 37
3.1.1.3.2.3.2 BESTIMMUNG DES IGG-SUBTYPS DER MONOKLONALEN
ANTIKOERPER. 39
3.1.1.3.3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 39
3.1.1.4 ISOLIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 39
3.1.1.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER ERHALTENEN FRAKTIONEN 40
3.1.1.4.1.1 QUANTIFIZIERUNG DER PROTEINE UND DEREN
IDENTIFIZIERUNG MITTELS SODIUMDODECYLSULFAT-
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 40
3.1.1.4.1.2. BESTIMMUNG DES ANTIKOERPERTITERS IN DEN FRAKTIONEN
(ELISA) 42
3.1.1.4.2 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 43
3.1.2 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER. 45
3.1.2.1 HERSTELLUNG VON FLUNITRAZEPAM-7-AZO-KLH 45
3.1.2.1.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES GEBUNDENEN 7- AMINOFLUNITRAZEPAM
IN FLUNITRAZEPAM-7-AZO-KLH
(HPLC) 46
3.1.2.1.2 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 46
3.1.2.2 IMMUNISIERUNG VON SCHAFEN, TITERBESTIMMUNG DER
ANTISEREN 47
3.1.2.3 ERMITTLUNG DER KREUZREAKTIVITAETEN DER ANTISEREN
(KOMPETITIONS-ELISA) 47
3.2 IMMUNADSORPTION 49
3.2.1 IMMOBILISIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER. 49
3.2.2 VERWENDUNG DER IMMUNADSORBER IA, IB UND II ZUR ANREICHERUNG
AUSGEWAEHLTER BENZODIAZEPINE AUS PUFFERLOESUNGEN 50
3.2.2.1 OPTIMIERUNG DER ELUTIONSBEDINGUNGEN BEI DER
IMMUNADSORPTION 50
3.2.2.1.1 UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE 51
3.2.2.2 BESTIMMUNG DER OXAZEPAM-BINDUNGSKAPAZITAET
UND -WIEDERFINDUNGSRATE BEI IMMUNADSORBER IA
UND IB 51 ,
IMAGE 4
IV
3.2.2.2.1 BATCH-VERFAHREN (IMMUNADSORBER IA) 51
3.2.2.2.2 SAEULENVERFAHREN (IMMUNADSORBER IB) 53
3.2.2.3 BESTIMMUNG DER BENZODIAZEPIN-BINDUNGS- KAPAZITAET UND
-WIEDERFINDUNGSRATE BEI
IMMUNADSORBER II 54
3.2.2.3.1 BINDUNGSKAPAZITAET UND WIEDERFINDUNGSRATE VON
IMMUNADSORBER II BEZUEGLICH OXAZEPAM 54
3.2.2.3.2 BINDUNGSKAPAZITAET UND WIEDERFINDUNGSRATE VON
IMMUNADSORBER II GEGENUEBER DEN METABOLITEN
EINIGER NIEDRIG DOSIERTER BENZODIAZEPINE 56
3.2.3 VERWENDUNG DES IMMUNADSORBERS II ZUR ANREICHERUNG VON
BENZODIAZEPINEN AUS PATIENTENURIN IM VERGLEICH ZU EINER
KONVENTIONELLEN FESTPHASENEXTRAKTIONSMETHODE (C 18) 57
3.2.3.1 URINPROBE 1 57
3.2.3.1.1 ANREICHERUNG VON BENZODIAZEPINEN AUS
URINPROBE I MITTELS IMMUNADSORPTION 57
3.2.3.1.2 CIS -FESTPHASENEXTRAKTION VON BENZODIAZEPINEN
AUS URINPROBE 1 59
3.2.3.2 URINPROBE II 60
3.2.3.2.1 ANREICHERUNG VON BENZODIAZEPINEN AUS
URINPROBE II MITTELS IMMUNADSORPTION 60
3.2.3.2.2 CIO -FESTPHASENEXTRAKTION VON BENZODIAZEPINEN
AUS URINPROBE II 61
4. MATERIAL UND METHODEN 62
4.1 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 62
4.1.1 HERSTELLUNG VON OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-KLH UND
OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-OVA 62
4.1.1.1 HERSTELLUNG VON OXAZEPAM-3-HEMISUCCINAT 62
4.1.1.1.1 CHARAKTERISIERUNG DES REAKTIONSPRODUKTS 63
4.1.1.1.1.1 DC-UNTERSUCHUNGEN 63
4.1.1.1.1.2 HPLC-UNTERSUCHUNGEN 64
4.1.1.1.1.3 NMR-UNTERSUCHUNGEN 65
4.1.1.2 HERSTELLUNG VON OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY- KLH UND
OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-OVA 65
4.1.1.2.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES GEBUNDENEN
OXAZEPAM IN OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-KLH
UND OXAZEPAM-3-HEMISUCCINYLOXY-OVA (HPLC).... 66
4.1.2 NACHWEIS VON ANTIKOERPERN GEGEN BENZODIAZEPINE MITTELS ELISA 67
4.1.2.1 ENTWICKLUNG EINES ELISA ZUM NACHWEIS VON
ANTIKOERPERN GEGEN BENZODIAZEPINE 68
4.1.2.2 VERWENDETE EUSA-TESTSYSTEME 70
4.1.2.2.1 DURCHFUEHRUNG EINER TITERBESTIMMUNG 71
4.1.2.2.2 DURCHFUEHRUNG EINES SCREENING-ELISA 72
4.1.2.2.3 DURCHFUEHRUNG EINES KOMPETITIONS-ELISA 72
4.1.3 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN UND ANTIKOERPERTITERBESTIMMUNG 73
4.1.3.1 IMMUNISIERUNGEN 74
4.1.3.2 BLUTENTNAHME UND 5. IMMUNISIERUNG 75
4.1.3.3 HERSTELLUNG VON HYBRIDOMEN ; 75
4.1.3.3.1 PRAEPARATION DER MILZZELLEN UND BESTIMMUNG DER
LYMPHOZYTEN-ZELLZAHL 75
4.1.3.3.2 ZELLFUSIONIERUNG UND PRIMAERKULTUR 76
4.1.3.3.3 KLONIERUNG ;... 77
4.1.3.3.4 PRODUKTION MONOKLONALER ANTIKOERPER IN
SUSPENSIONSKULTUREN SOWIE IM MINIPERM- BIOREAKTORSYSTEM 77
4.1.3.3.5 BESTIMMUNG DES IMMUNGLOBULIN-SUBTYPS 78
4.1.4 ISOLIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER AUS KULTURUEBERSTAENDEN 79
4.1.4.1 IMMOBILISIERUNG VON ANTI-MAUS-FC-IGG AN CNBR- AKTIVIERTE AGAROSE
79
4.1.4.2 ISOLIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER AUS KULTUR- UEBERSTAENDEN 80
4.1.4.2.1 BATCH-VERFAHREN 81
4.1.4.2.2 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON PROTEINEN 81
4.1.4.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER FRAKTIONEN MITTELS
SODIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGEL- ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 83
4.1.4.2.4 DIALYSE UND LYOPHILISIERUNG 85
IMAGE 5
VI
4.2 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 86
4.2.1 HERSTELLUNG VON FLUNITRAZEPAM-7-AZO-KLH 86
4.2.1.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES GEBUNDENEN 7- AMINOFLUNITRAZEPAM IN
FLUNITRAZEPAM-7-AZO-KLH
(HPLC) 86
4.2.2 IMMUNISIERUNG VON SCHAFEN 87
4.2.3 TITERBESTIMMUNG UND BESTIMMUNG DER KREUZREAKTIVITAETEN DER
ANTISEREN 88
4.3 IMMOBILISIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 90
4.3.1 IMMOBILISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER M 5 AN GDA-
AKTIVIERTES AMINOSPHEROSIL 90
4.3.2 IMMOBILISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER M 5 AN CNBR-
AKTIVIERTE AGAROSE 91
4.4 VERWENDUNG DER IMMUNADSORBER IA, IB UND II ZUR ANREICHERUNG
AUSGEWAEHLTER BENZODIAZEPINE AUS PUFFERLOESUNGEN 92
4.4.1 OPTIMIERUNG DER ELUTIONSBEDINGUNGEN BEI DER
IMMUNADSORPTION 92
4.4.2 BESTIMMUNG DER OXAZEPAM-BINDUNGSKAPAZITAET UND - WIEDERFINDUNGSRATE
BEI IMMUNADSORBER IA UND IB 93
4.4.2.1 IMMUNADSORBER IA (BATCH-VERFAHREN) 94
4.4.2.2 IMMUNADSORBER IB (SAEULEN-VERFAHREN) 95
4.4.3 BESTIMMUNG DER BENZODIAZEPIN-BINDUNGSKAPAZITAET UND
-WIEDERFINDUNGSRATE BEI IMMUNADSORBER II... 96
4.5 VERWENDUNG DES IMMUNADSORBERS II ZUR ANREICHERUNG VON
BENZODIAZEPINEN AUS PATIENTENURIN IM VERGLEICH ZU EINER
KONVENTIONELLEN FESTPHASENEXTRAKTIONSMETHODE (CIS) 97
4.5.1 ANREICHERUNG VON BENZODIAZEPINEN AUS URINPROBEN MITTELS
IMMUNADSORPTION 97
4.5.2 CIS-FESTPHASENEXTRAKTION VON BENZODIAZEPINEN AUS URINPROBEN 98
5. DISKUSSION 100
6. ZUSAMMENFASSUNG 107
7. LITERATURVERZEICHNIS 108
ANHANG 116
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