Klonierung und Charakterisierung neuer Mitglieder der ClC-Chloridkanal-Familie:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1997
|
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
_
1
1.1.
MEMBRANTRANSPORT
-
.
_
.
_
.1
L2.
CHLORIDKANAELE._.YY.YY.2
13.
DIE
CLC-FAMILIE
DER
SPANNUNGSABHAENGIGEN
CHLORIDKANAELE
.
_
.5
L4.
CHARAKTERISIERUNG
VON
LONENKANAELEN
.7
13.
AUFGABENSTELLUNG
.
-----
.
.
8
2.
MATERIALIEN
_
10
2.1.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
10
2.2
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
10
2.3.
FILMMATERIAL
.
11
2.4.
BAKTERIENSTAEMME
.
11
2.5.
MEDIEN
UND
PLATTEN
FUER
BAKTERIEN
.
11
2.6.
VEKTOREN
.
11
2.7.
CDNA-BIBLIOTHEKEN
.
12
3.
METHODEN
_
12
3.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
.
.
12
3.2.
DURCHMUSTERN
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
.
12
3.3.
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
13
3.3.1.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
13
3.3.2.
PRAEPARATION
VON
-
AEPHAGEN-DNA
.
13
3.4.
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
13
3.4.1.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
13
3.4.2.
ISOLIERUNG
VON
RNA
.
14
3.5.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
14
3.5.1.
AGAROSE-GELE
.
14
3.5.2.
POLYACRYLAMID-GELE
.
14
3.6.
KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
15
3.6.1.
LIGATION
.
15
3.6.2.
TRANSFORMATION
.
15
3.7.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNA
.
15
3.7.1.
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
.
15
3.7.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
15
3.7.3.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
16
3.8.
IN
VITRO
SYNTHESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
16
3.8.1.
IN
VITRO
CRNA-SYNTHESE
.
16
3.8.2.
IN
VITRO
CDNA-SYNTHESE
.
16
3.9.
HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
.
17
3.9.1.
NORTHERN-BLOT
ZUR
ANALYSE
VON
RNA
AUS
GEWEBE
.
17
3.9.2.
HYBRIDISIERUNG
.
17
3.10.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
18
3.11.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
.
18
3.11.1.
KLONIERUNG
DER
N-TERMINALEN
SEQUENZ
VON
RCLC-7
(RACE)
.
19
3.11.2.
RT-PCR
.
20
3.11.2.1.
RT-PCR
FUER
DIE
KLONIERUNG
NEUER
CIC-KANAELE
.
20
3.11.3.
REKOMBINANTE
PCR
.
23
3.12.
KONSTRUKTION
VON
MUTANTEN
UND
CHIMAEREN
.
-----------------------
.
_
24
3.12.1.
KONSTRUKTION
VON
DELETIONSMUTANTEN
.
24
3.12.2.
KONSTRUKTION
N-
UND
C-TERMINALER
CHIMAEREN
.
25
3.12.2.1.
KONSTRUKTION
VON
CHIMAEREN
VON
C1C-6
MIT
C1C-1.
25
3.12.2.2.
KONSTRUKTION
VON
R/HCLC-7
.
26
3.12.2.3.
KONSTRUKTION
VON
CHIMAEREN
VON
C1C-7
MIT
C1C-1.
26
3.12.3.
KONSTRUKTION
VON
PUNKTMUTATIONEN
.
28
3.12.3.1.
PUNKTMUTATIONEN
AN
C1C-6
.
28
3.12.3.2.
PUNKTMUTATIONEN
AN
C1C-7
.
29
3.13.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
_
30
3.13.1.
ZELLINIEN
.
30
3.13.2.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
.
31
3.13.3.
TRANSFEKTION
VON
ZELLINIEN
.
31
3.13.3.1.
KALZIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION
.
31
3.13.3.2.
DEAE-TRANSFEKTION
.
31
3.13.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
ZELLEN
.
32
3.14.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
METHODEN
.
32
3.14.1.
ANALYSE
VON
XENOPUS-OOZYTEN
.
32
3.14.2.
ANALYSE
VON
ZELLINIEN
.
33
3.15.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
.
YY
.
33
3.15.1.
HERSTELLUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
PEPTIDANTIKOERPER
.
33
3.15.1.1.
HERSTELLUNG
DER
PEPTIDANTIKOERPER
.
33
3.15.1.2.
AUFREINIGUNG
DES
PEPTID-ANTIKOERPERS
GEGEN
C1C-7.
33
3.15.2.
IN VITRO
TRANSLATION
UND
GLYKOSYLIERUNG
.
34
3.15.3.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
34
3.15.4.
AUFTRENNUNG
UND
IMMUNDETEKTION
VON
PROTEINEN
.
34
3.15.4.1.
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
.
34
3.15.4.2.
WESTEM-BLOTS
.
35
3.16.
IMMUNHISTOCHEMIE
.35
3.16.1.
FIXIERUNG
UND
SCHNEIDEN
.
35
3.16.2.
DAB-FAERBUNG
.
36
3.16.3.
NISSL-FAERBUNG
.
36
3.17.
IMMUNFLUORESZENZ.
_
.
_
.
_
.37
3.17.1.
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
.
37
3.17.2.
KONFOKALE
LASERMIKROSKOPIE
.
38
4.
ERGEBNISSE
----------------------------------------------------------------------------------------
39
4.1.
KLONIERUNG DER
PUTATIVEN
KANAELE
.
39
4.2.
CHROMOSOMALE
LOKALISATION DER
PUTATIVEN
CHLORIDKANAELE
.
43
4.3.
HYDROPATHIEANALYSE
VON
C1C-6
UND
C1C-7
.
43
4.4.
GEWEBEVERTEILUNG
VON
C1C-6
UND
C1C-7
.
45
4.5.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.
-
.
48
4.5.1.
FUNKTIONELLE
EXPRESSION
DER
PUTATIVEN
CHLORIDKANAELE
C1C-6
UND
C1C-7
.
48
4.5.2. EXPRESSION
DER
PUTATIVEN
CHLORIDKANAELE
C1C-6
UND
C1C-7
IN
ZELLINIEN
.
49
4.6.
EXPRESSION
VON
DELETIONSMUTANTEN,
CHIMAEREN
UND
PUNKTMUTANTEN
.
_
.50
4.6.1.
EXPRESSION
VON
DELETIONSMUTANTEN
.
51
4.6.2.
EXPRESSION
VON
C-TERMINALEN
CHIMAEREN
MIT
C1C-1.
51
4.6.3.
EXPRESSION
VON
CHIMAEREN
MIT
C1C-1
ZWISCHEN
D8
UND
D9
.
52
4.6.4.
EXPRESSION
VON
C-TERMINALEN
PUNKTMUTANTEN
.
53
4.6.4.I.
MUTATION
DES
PUTATIVEN
INTEMALISIERUNGSMOTIVS
YXRY
UND
YPRF
.
54
4.6.4.2.
MUTATION
DER
PUTATIVEN
INTEMALISIERUNGSMOTIVE
FXNPXY
UND
NPXXY
.
54
4.OE.4.3.
MUTATION
DER
PUTATIVEN
INTEMALISIERUNSMOTIVE
YEFL
UND
YQTI
IN
C1C-6.
55
4.7.
IN
VITRO
TRANSLATION
UND
GLYKOSYLIERUNG
DER
CIC-KANAELE
_
.56
4.8.
HERSTELLUNG
VON
PEPTIDANTIKOERPERN.
_
.57
4.9.
INUNUNPRAEZIPITATION.
-----
.
------------.------------
.
-
58
4.9.1.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
IN
VITRO
TRANSLATIONSPRODUKTEN
.
58
4.9.2.
WESTERN-BLOT
MIT
AFFINITAETSGEREINIGTEM
ANTIKOERPER
AK1558
.
60
4.9.3.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
METABOLISCH
MARKIERTEM
PROTEIN
.
61
4.10.
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
AN
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
_
.
----
.
-
.62
4.10.1.
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
AN
C1C-7
TRANSFIZIERTEN
COS-ZELLEN
.
62
4.10.2.
IMMUNFLUORESZENZANALYSE
AN
C1C-1
TRANSFIZIERTEN
COS-ZELLEN
.
65
4.11.
INUNUNHISTOCHEMISCHE
ANALYSE
.
-
.
-
.67
5.
DISKUSSION
-----------------------------------------------------------------------------------------
71
5.1.
KLONIERUNG
UND
EIGENSCHAFTEN
PUTATIVER
CHLORIDKANAELE
.
71
5.2.
FUNKTION
DER
PUTATIVEN
CHLORIDIONENKANAELE
.
74
5.3.
ROLLE
DER
CHLORIDIONENKANAELE
IN
INTRAZELLULAEREN
ORGANELLEN
.
76
5.4.
UNTERSUCHUNG
VON
PUTATIVEN
INTEMALISIERUNGSSIGNALEN
IN
C1C-6
UND
C1C-7.
77
5.5.
CHARAKTERISIERUNG
DES
C1C-7
ANTIKOERPERS
.
80
5.6.
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
.
81
5.7.
VERTEILUNG
DES
PUTATIVEN
CHLORIDIONENKANALS
C1C-7
IM
RATTEN-GEHIM
.
83
ABKUERZUNGEN
---------------------------------------------------------------------------------------
88
LITERATURVERZEICHNIS
_
90 |
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