Isolierung, Expression und Charakterisierung zweier humaner cDNA-Klone, die für Ca 2+ -permeable Kationenkanäle codieren:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
1
1.1
KOMMUNIKATION
IN
ORGANISMEN
1
1.2
INTRAZELLULAERE
BOTENSTOFFE
2
1.3
BEDEUTUNG
VON
CA
2+
ALS
INTRAZELLULAERER
BOTENSTOFF
3
1.4
FREISETZUNG
VON
CA
2+
AUS
INTRAZELLULAEREN
SPEICHERN
4
1.5
MECHANISMEN
DES
CA
2+
-EINSTROMS
6
1.6
MIT
YYPI
RESPONSE
"
EINHERGEHENDER
CA
2+
-EINSTROM
8
1.7
SIGNALTRANSDUKTION
IN
PHOTOREZEPTORZELLEN
11
1.8
CHARAKTERISIERUNG
DER
KATIONENSTROEME
AN
PHOTOREZEPTORZELLEN
VON
DROSOPHILA
MELANOGASTER
13
1.9
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRP
UND
TRPL
IN
HETEROLOGEN
EXPRESSIONSSYSTEMEN
14
1.10
MOLEKULARE
STRUKTUR
DER
KATIONENKANAELE
TRP
UND
TRPL
16
2
ZIELSETZUNG
20
3
MATERIAL
3.1
HERSTELLER
UND
LIEFERANTEN
22
3.2
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
22
3.2.1
CHEMIKALIEN
22
3.2.2
ENZYME
23
3.2.2.1
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
23
3.2.2.2
ANDERE
ENZYME
23
3.3
NUKLEOTIDE,
NUKLEINSAEUREN
UND
GENBANKEN
23
3.3.1
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
23
3.3.2
RADIOAKTIV
MARKIERTE
NUKLEOTIDE
24
3.3.3
GENBANKEN
24
3.3.4
WEITERE
NUKLEINSAEUREN
UND
NUKLEOTIDE
24
3.4
ZELLEN
UND
ORGANISMEN
25
3.4.1
ESCHERICHIA
COLI
STAEMME
25
3.4.2
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
25
3.4.3
XENOPUS
LAEVIS
25
3.5
SONSTIGE
VERBRAUCHSMATERIALIEN
25
3.6
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
25
3.6.1
LOESUNGEN
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
25
3.6.2
MEDIEN
26
3.6.2.1
MEDIEN
FUER
BAKTERIENKULTUREN
26
3.6.2.2
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
.
27
3.7
KITS
27
3.8
COMPUTERPROGRAMME
27
4
METHODEN
28
4.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
28
4.1.1.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
UND
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
28
4.1.1.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION'
28
4.1.1.2
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
28
4.1.1.3
KLONIERUNG
VON
PCR-AMPLIFIKATEN
29
4.1.2
DURCHSUCHEN
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
MIT
RADIOAKTIVEN
DNA-SONDEN
29
4.1.2.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
N
4.1.2.2
TITERBESTIMMUNG
UND
AUSPLATTIERUNG
VON
LAMDA-PHAGEN
CDNA-BIBLIOTHEKEN
30
4.1.2.3
TRANSFER
VON
PHAGEN-DNA
AUF
NITROCELLULOSEMEMBRAN
31
4.1.2.4
HYBRIDISIERUNG
VON
MEMBRANEN
MIT
RADIOAKTIVEN
DNA-SONDEN
31
4.1.2.5
AUSWERTUNG
DER
AUTORADIOGRAMME
32
4.1.2.6
ISOLIERUNG
EINZELNER
PHAGENPLAQUES
33
4.1.2.7
UMKLONIERUNG
VON
CDNA-INSERTIONEN
AUS
LAMDA-PHAGEN
IN
PLASMIDE
33
4.1.3
DNA-SEQUENZIERUNG
UND
DNA-SEQUENZANALYSEN
34
4.1.3.1
DNA-SEQUENZIERUNG
34
4.1.3.2
SEQUENZANALYSEN
UND
DATENBANKSUCHEN
34
4.1.4
WEITERE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
35
4.1.4.1
YYSOUTHEM-BLOT
"
-ANALYSEN
35
4.1.4.2
RNA-ISOLIERUNG
AUS
ZELLEN
IN
KULTUR
35
4.1.4.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
35
4.2
GENEXPRESSION
IN
EUKARYONTISCHEN
SYSTEMEN
36
4.2.1
GENEXPRESSION
IN
CHO-ZELLEN
36
4.2.1.1
ZELLKULTUR
VON
CHO-ZELLEN
36
4.2.1.2
INTRANUKLEAERE
INJEKTION
VON
DNA
IN
CHO-ZELLEN
36
4.2.1.3
TRANSFEKTION
VON
CHO-ZELLEN
37
4.2.2
BACULOVIRUS/SF9-SYSTEM
37
4.2.2.1
ZELLKULTUR
VON
SF9-ZELLEN
37
4.2.2.2
DARSTELLUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
38
4.2.2.3
ISOLIERUNG
EINZELNER
VIRENPLAQUES
38
4.2.3
GENEXPRESSION
IN
XENOPUS-OOZYTEN
39
4.2.3.1
ISOLIERUNG
VON
XENOPUS-OOZYTEN
39
4.2.3.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
UND
INJEKTION
VON
XENOPUS-OOZYTEN
39
4.3
MESSUNGEN
DER
INTRAZELLULAEREN
FREIEN
CA
2+
-KONZENTRATION
([CA
2+
]J)
MITTELS
FURA-2
40
4.3.1
EINZELZELLMESSUNG
VON
CHO-ZELLEN
40
4.3.2
SUSPENSIONSMESSUNGEN
VON
SF9-ZELLEN
41
4.4
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
MIT
HILFE
DER
PATCH-CLAMP-TECHNIK
41
4.4.1
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
AN
CHO-ZELLEN
41
4.4.2
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
AN
SF9-ZELLEN
42
4.4.3
MESSUNG
DES
CA
2+
-INDUZIERTEN
CL'-STROMES
UEBER
DIE
ZELLMEMBRAN
VON
XENOPUS-OOZYTEN
42
5
ERGEBNISSE
43
5.1
ENTWICKLUNG
DER
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
43
5.2
DURCHSUCHEN
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
AUS.
SAEUGERGEWEBEN
MIT
DNA-SONDEN
VON
TRP
UND
TRPL
46
5.2.1
KONSTRUKTION
VON
DNA-SONDEN
46
5.2.2
ETABLIERUNG
VON
VERSUCHSBEDINGUNGEN
FUER
DAS
DURCHSUCHEN
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
46
5.2.3
SUCHE
NACH
TRP
BZW.
TRPL-VERWANDTEN
SEQUENZEN
IN
CDNA-BIBLIOTHEKEN
AUS
SAEUGERGEWEBEN
48
5.3
DURCHSUCHEN
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
MIT
DNA-SONDEN
VON
SAEUGER-ESTS
49
5.3.1
ESTS
MIT
SEQUENZAEHNLICHKEIT
ZU
TRP
UND
TRPL
49
5.3.2
HERSTELLUNG
VON
DNA-SONDEN
MIT
SEQUENZEN
DER
ESTS
51
5.3.3
ISOLIERUNG
VON
TRPC1A
52
5.3.4
SEQUENZ
VON
TRPC1A
54
5.3.5
ISOLIERUNG
VON
TRPC3
58
IN
5.3.6
SEQUENZ
VON
TRPC3
62
5.3.7
SEQUENZVERGLEICH
VON
TRPC
1
A
UND
TRPC3
MIT
ANDEREN
MITGLIEDERN
DER
TRP-FAMILIE
63
5.4
EXPRESSION
VON
TRPC1A
UND
TRPC3
65
5.4.1
AUSWAHL
GEEIGNETER
EXPRESSIONSSYSTEME
/
KLONIERUNG
VON
TRPC1A
UND
TRPC3
IN
EUKARYONTISCHE
EXPRESSIONSVEKTOREN
65
5.4.2
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
TRPC1A
IN
STABIL-EXPRIMIERENDEN
CHO-ZELLEN
69
5.4.3
NACHWEIS
DER
77?PC7A-CDNA
IN
REKOMBINANTEN
BACULOVIREN
70
5.4.4
NACHWEIS
DER
GENEXPRESSION
IN
MIKROINJIZIERTEN
CHO-ZELLEN
71
5.5
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRPC1A
72
5.5.1
MESSUNGEN
DER
INTRAZELLULAEREN
FREIEN
CA
2+
-KONZENTRATION
([CA
2+
]J)
72
5.5.1.1
FLUOROMETRISCHE
MESSUNGEN
DER
[CA
2+
]J
IN
CHO-ZELLEN
72
5.5.1.2
FLUOROMETRISCHE
MESSUNGEN
DER
[CA
2+
]J
IN
SF9-ZELLEN
73
5.5.1.3
MESSUNG
CA
2+
-ABHAENGIGER
CF-STROEME
AN
XENOPUS-OOZYTEN
75
5.5.2
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
MIT
DER
PATCH-CLAMP-TECHNIK
76
5.5.2.1
PATCH-CLAMP-MESSUNGEN
AN
CHO-ZELLEN
76
5.5.2.2
PATCH-CLAMP-MESSUNGEN
AN
SF9
ZELLEN
80
5.6
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRPC3
81
5.6.1
FLUOROMETRISCHE
MESSUNGEN
DER
[CA
2+
]
J
IN
MIKROINJIZIERTEN
CHO-ZELLEN
81
5.6.2
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
MIT
DER
PATCH-CLAMP-TECHNIK
82
6
DISKUSSION
87
6.1
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
87
6.2
N-TERMINALE
VARIANTEN
VON
TRPC1A
88
6.3
STRUKTURMODELLE
90
6.4
DIE
WACHSENDE
TRP-GENFAMILIE
92
6.5
EXPRESSION
VON
TRPC1A
UND
TRPC3
95
6.6
TRPC1A
UND
TRPC3
CODIEREN
FUER
LONENKANAELE
96
6.7
VERGLEICH
DER
TRPC1A
UND
TRPC3-STROEME
MIT
STROEMEN,
DIE
AN
SAEUGERZELLEN
CHARAKTERISIERT
WURDEN
97
6.8
REGULATION
VON
TRPC3
99
6.9
VERGLEICH
DER
STROEME,
DIE
DURCH
EXPRESSION
VON
MITGLIEDERN
DER
TRP-GENFAMILIE
AUSGELOEST
WERDEN
100
7
ZUSAMMENFASSUNG
103
8
LITERATURVERZEICHNIS
105
9
ANHANG
118
VEROEFFENTLICHUNGEN
118
DANKSAGUNG
119
LEBENSLAUF
120 |
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