Serin-Threonin-Proteinphosphorylierung in Alveolarmakrophagen nach Aktivierung mit Quarzstäuben und metalloxid-beschichtete Partikeln:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
1
1.1
ALVEOLARMAKROPHAGEN
1
1.2
PATHOGENE
WIRKUNG
VON
MINERALISCHEN
UND
METALLHALTIGEN
PARTIKELN
NACH
INHALATION
3
1.3
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
IN
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
5
1.3.1
DIE
PROTEINKINASE
C-ISOENZYMFAMILIE
7
1.3.2
SIGNAL
TRAEN
SDUKTION
11
1.3.3
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
IN
MAKROPHAGEN
15
1.3.
AKTIVIERUNG
UND
REGULATION
DER
NADPH-OXIDASE
17
2
PROBLEMSTELLUNG
3
MATERIAL
UND
METHODEN
3.1
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
RINDERALVEOLARMAKROPHAGEN
25
3.2
ZELLKULTURMEDIEN
UND
LOESUNGEN
27
3.2.1
VERWENDETE
KULTURSCHALEN
28
3.3
IN
VIVO
MARKIERUNG
VON
RAM
MIT
32
[P]-ORTHOPHOSPHAT
29
3.4
STIMULATION
VON
RAM
29
3.4.1
AGONISTEN
30
3.4.1.1
HERSTELLUNG
VON
METALLOXID-BESCHICHTETEN
LICHROSPHERE
SILICA-PARTIKELN
(LIC)
31
3.5
ANALYTIK
VON
RAM-ZELLFUNKTIONEN
32
3.5.1
VITALITAETSBESTIMMUNG
VON
RAM
32
3.5.2
RESPIRATORY
BUERST:
MESSUNG
REAKTIVER
SAUERSTOFFVERBINDUNGEN
33
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
3.5.2.1
MESSUNG
DER
SUPEROXIDANIONEN-FREISETZUNG
(O*
2
~)
33
3.5.2.2
MESSUNG
DER
WASSERSTOFFPEROXID-FREISETZUNG
VON
RAM
34
3.5.3
MESSUNG
DER
PROTEASE-AKTIVITAET
35
3.6
MESSUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
CALCIUMKONZENTRATION
(C[CA
2+
]J)
37
3.6.1
FLUOROMETRISCHE
MESSUNG
DERC[CA
2+
]J
37
3.6.2
DURCHFIUSSZYTOMETRISCHE
MESSUNG
VON
C[CA
2+
]J
38
3.7
ZELLAUFSCHLUSS
UND
PROTEINEXTRAKTION
39
3.7.1
FRAKTIONIERUNG
VON
ZYTOSOL-UND
MEMBRAN-FRAKTION
NACH
DIGITONIN
ZELLPERMEABILISIERUNG
39
3.7.2
FRAKTIONIERTE
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
RAM
40
3.7.3
PROTEINEXTRAKTION
ZUR
ANREICHERUNG
VON
PKC
DURCH
DEAE
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
41
3.7.4
ZELLKEMISOLIERUNG
41
3.7.5
GESAMTPROTEINEXTRAKTION
FUER
DIE
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF,
IPG)
UND
2D-PAGE
(ISO/DALT)
42
3.7.6
PROTEASE-INHIBITOREN
43
3.8
PROTEIN
UND
ENZYM-ANALYTIK
44
3.8.1
PROTEINBESTIMMUNG
44
3.8.1.1
BCA-PROTEINBESTIMMUNG
NACH
SMITH
ET
AL.
(1985)
44
3.8.1.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
RAMAGLI
44
3.8.2
METHODEN
ZUR
ANREICHERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
45
3.8.2.1
PROTEINFAELLUNG
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
45
3.8.2.2
ACETON-PRAEZIPITATION
45
3.8.2.3
ULTRAFILTRATION
46
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
3.8.2.4
ANREICHERUNG
VON
PKC
AUS
RAM-HOMOGENATEN
DURCH
DEAE-
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
IM
BATCH-ADSORPTIONS-VERFAHREN
47
3.8.3
FLUOROMETRISCHE
MESSUNG
DER
PROTEINKINASE
C-AKTIVITAET
48
3.8.3.1
MESSUNG
DER
PKC-AKTIVITAET
IN
VITRO
48
3.8.3.2
MESSUNG
DER
PKC-AKTIVITAET
IN
VERSCHIEDENEN
RAM-HOMOGENATEN
NACH
STIMULATION
50
3.9
POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
51
3.9.1
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
51
3.9.1.1
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
MIT
TRAEGERAMPHOLYTEN
(CA-IEF)
51
3.9.1.2
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG
IN
IMMOBILISIERTEN
PH-GRADIENTEN
53
3.9.1.3
BESTIMMUNG
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
VON
PROTEINEN
NACH
IEF
56
3.9.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
57
3.9.2.1
VERTIKALE
SDS-PAGE
59
3.9.2.2
HORIZONTALE
SDS-PORENGRADIENTEN
PAGE
60
3.9.3
ZWEIDIMENSIONALE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(2D-PAGE)
63
3.10
DETEKTION
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
(PA-GELE)
66
3.10.1
COOMASSIE-STANDARDFAERBUNG
VON
PA-GELEN
66
3.10.2
MODIFIZIERTE
COOMASSIE-FAERBUNG
FUER
DIE
ANSCHLIESSENDE
ELEKTRO
ELUTION
VON
PROTEINEN
66
3.10.3
SILBERFAERBUNG
VON
LEF-UND
IPG-PA-GELE
NACH
MERRIL
(1981)
67
3.10.4
SILBERFAERBUNG
VON
SDS-PA-GELEN
NACH
HEUKESHOVEN
UND
DEMICK
(1986)
68
3.10.5
NACHWEIS
VON
32
[P]-MARKIERTEN
PHOSPHOPROTEINEN
IN
PA-GELEN
DURCH
AUTORADIOGRAPHIE
69
3.11
DENSITOMETRIE
UND
DATENAUSWERTUNG
69
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
3.12
IDENTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
NACH
ELEKTROPHORETISCHER
TRENNUNG
70
3.12.1
ELEKTROPHORETISCHER
TRANSFER
VON
PROTEINEN
71
3.12.1.1
ELEKTROPHORETISCHER
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-PA-GELEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
(ELEKTROBLOTTING)
71
3.12.1.2
ELEKTROELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
PA-GELEN
72
3.12.1.3
LYS-C-SPALTUNG
VON
ELEKTROELUIERTEN
PROTEINEN
73
3.13
REVERSE-PHASE
HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE
(RP-HPLC)
VON
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
74
3.14
CHEMIKALIEN
UND
LOESUNGSMITTEL
75
3.15
GERAETE
&
SOFTWARE
77
4
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
80
4.1
RAM-ZELLKULTURTECHNIK
80
4.1.1
ISOLIERUNG,
CHARAKTERISIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
RAM
80
4.1.2
32
[P]-ORTHOPHOSPHAT-MARKIERUNG
VON
RAM
81
4.2
FLUOROMETRISCHE
MESSUNG
DER
PKC-AKTIVITAET
IN
RAM-HOMOGENATEN
UND
DEAE-IEC/UF-PROTEINFRAKTIONEN
82
4.2.1
FLUOROMETRISCHE
MESSUNG
DER
IN
VIVO-INDUZIERTEN
PKC-AKTIVIERUNG
UND
TRANSLOKATION
IN
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
AGONISTEN
86
4.3
MESSUNG
DER
PROTEASE-AKTIVITAET
IN
RAM-ZELLFRAKTIONEN
NACH
STIMULATION
93
4.4
VERAENDERUNGEN
IM
SDS-PAGE-PROTEINMUSTER
VON
RAM-ZELL
FRAKTIONEN
NACH
STIMULATION
MIT
ZYMOSAN
UND
PMA.
99
4.5
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
IN
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
VERSCHIEDENEN
AGONISTEN
103
4.5.1
OPTIMIERUNG
DER
1D/2D-SDS-PAGE
ZUR
TRENNUNG,
DETEKTION
UND
QUANTIFIZIERUNG
VON
32
[P]-PHOSPHAT-MARKIERTEN
PROTEINEN
AUS
RAM
103
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
4.5.2
ANALYSE
DER
LD-SDS-PAGE-PHOSPHOPROTEINMUSTER
NACH
INKUBATION
MIT
PMA,
ZYMOSAN
UND
GF
109203X
106
4.5.3
OPTIMIERUNG
DER
2D-PAGE
ZUR
TRENNUNG
VON
RAM-PROTEINEN
112
4.5.4
VERGLEICH
DER
2D-PROTEINMUSTER
VON
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
PMA,
CDO-BESCHICHTETEN
SILIKA
PARTIKELN
UND
SIKRON
F600
114
4.5.5
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
VON
RAM-PROTEINEN
NACH
2D-PAGE
116
4.5.6
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
IN
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
UNBESCHICH
TETEN
UND
METALLOXID-BESCHICHTETEN
LICHROSPHERE-SILICA-PARTIKELN
119
4.5.7
OPTIMIERUNG
DER
MODIFIZIERTEN
CA-IEF/DALT-TECHNIK
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
VON
RAM-PHOSPHOPROTEINEN
123
4.5.8
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
IN
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
PMA,
LIC-CDO
UND
SIKRON
F600
123
4.5.9
SEQUENZIERUNG
VON
RAM-PHOSPHOPROTEINEN
NACH
2D-PAGE
127
4.5.10
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
IN
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
PMA,
LIC-CDO
UND
SIKRON
F600
,
132
4.6
VITALITAET
VON
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
PMA,
LIC-CDO
UND
SIKRON
F600
143
4.7
MESSUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
CALCIUM-KONZENTRATION
(C[CA
2+
]J)
IN
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
PMA,
LIC-CDO
UND
SIKRON
F600
145
4.8
FREISETZUNG
VON
REAKTIVEN
SAUERSTOFFINTERMEDIATEN
(ROI)
DURCH
RAM
NACH
STIMULATION
MIT
PMA,
LIC-CDO
UND
SIKRON
F600
149
4.8.1
SUPEROXIDANIONEN
-FREISETZUNG
149
4.8.2
WASSERSTOFFPEROXID-FREISETZUNG
VON
RAM
151
4.9
ZUSAMMENFASSENDE
DISKUSSIQN
152
5
ZUSAMMENFASSUNG
159
6
LITERATURVERZEICHNIS
162 |
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