Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung der Alpha-Glucuronidase von Thermotoga maritima MSB8:
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
EINLEITUNG
.
1
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
6
1.
BAKTERIEN,
PLASMIDE
UND
ANTIBIOTIKA
.
6
1
1.
BAKTERIEN
.
6
1.2.
PLASMIDE
.
7
1
3.
ANTIBIOTIKA
.
12
2.
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
.
12
2.1.
NAEHRMEDIEN
FUER
E.
COLI
.
12
2
2.
NAEHRMEDIUM
FUER
T.MARITIMA
.
12
2.3.
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
VON
E.COLI
.
15
2
4.
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
VON
T.MARITIMA
.
15
2.5.
ZELLEMTE
.
16
2.6.
INDUKTION
DES
LACF/PUC-SYSTEMS
.
17
3.
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
17
4.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
.
18
4.1.
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.
COLI
.
18
4
1.1.
PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
DURCH
ULTRAZENTRIFUGATION
.
18
4.1.2.
PLASTNIDISOLIENMG
MIT
QIAGEN
PLASMID
MIDI
KIT
.
19
4.1.3.
PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG
.
20
4
1.3.1.
ALKALISCHE
LYSE
.
20
4.1.3.2.
OIAPREP
SPIN
PLASMID
MINIPREP
KIT
.
20
4.2.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNS
.
21
4
2.1.
PHENOLEXTRAKTION
.
21
4.2.2.
ETHANOLFAELLUNG
.
21
4.3.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
22
4.3.1.
ANALYTISCHE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
22
4.3.2.
GROESSENBESTIMMUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
23
4.3.3.
KONZENTRATIONSABSCHAETZUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
23
4.3.4.
PRAEPARATIVE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
24
4.3.5
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
.
24
4.4.
IN-VITRO
MANIPULATION
VON
DNS
.
24
4.4
1.
RESTRIKTIONSVERDAUUNG
.
24
4.4.2.
LIGATION
VON
DNS-MOLEKUELEN
.
25
4.4.3.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
26
4.4.4.
KLENOWBEHANDLUNG
.
26
4.5.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
DURCH
ELEKTROPORATION
.
27
4.6.
DNS-TRANSFER
NACH SOUTHERN
.
28
4.7.
IN
VITRO
AMNLIFIZIERUNG
VON
DNS
DURCH
PCR
.
30
4.8
HERSTELLUNG
UNIDIREKTIONALER
DELETIONEN
DURCH
EXONUCLEASE
III-BEHANDLUNG
.
31
4.9.
SEQUENZIERUNG
.
33
4.9.1.
SEQUENZIERUNGSREAKTION
.
33
4.9.2.
GELELEKTROPHORESE:
YYDIRECT-BLOTTING
ELEKTROPHORESE
"
.
35
4.9.3.
DETEKTION
.
37
5.
GEWINNUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
AUS
ZELLEN
.
39
5
1.
LYSOZYMAUFSCHLUSS
VON
E.COLI
.
39
5.2.
ZELLAUFSCHLUSS
MIT
DER
FRENCH
PRESS
.
39
5.3.
HITZEFAELLUNG
VON
MESOPHILEN
WIRTSPROTEINEN
.
40
5.4
KONZENTRIEREN
UND
ENTSALZEN
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
40
5
4.1.
DIALYSE
.
40
5
4.2.
VERWENDUNG
VON
MIKROKONZENTRATOREN
.
40
5.5.
BESTIMMUNG
DES
GESAMTPROTEINS
.
41
6.
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
41
6.1.
BENOETIGTE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
42
6.2.
HERSTELLEN
DER
GELE
.
43
6.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
.
44
6.4.
PROTEINFAERBUNG
MIT
COOMASSIE
R250
.
44
6.5.
MOLEKULARMASSENBESTIMMUNG
DURCH
PAGE
.
44
7.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSIERUNG
DURCH
PAGE
.
45
8.
ENZYMCHARAKTERISIERUNG
.
46
8.1.
SUBSTRATHERSTELLUNG
.
46
8.1.1.
KOMBINIERTER
ENZYMATISCHER
VERDAU
EINES
SUBSTITUIERTEN
XYLANS
.
46
8.1.2.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
TRENNUNG
DER
ABBAUPRODUKTE
.
47
8.2.
CHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSEN
.
49
8.2.1
PRODUKTANALYSE
DURCH
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
49
8.2.2.
PRODUKTANALYSE
DURCH
HOCHLEISTUNGS-FLUESSIG-CHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
.
50
8.3.
ARSENOMOLYBDAT-KUPFERSULFAT-TEST
ZUR
BESTIMMUNG
DER
GLUCURONIDASEAKTIVITAET.
50
8.3.1.
TESTPRINZIP
.
50
8.3.2.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
51
8
3.3
TESTANSATZ
(IM
1,5
ML
EPPENDORF-CAP)
.
52
8.4.
BESTIMMUNG
REDUZIERENDER
ZUCKER
MITTELS
DNSA-TEST
.
53
8.5
STANDARDASSAY
FUER
XYLANASEAKTIVITAET
.
54
8.6.
STANDARDASSAY
FUER
SS-XYLOSIDASEAKTIVITAET
.
54
8.7.
STANDARDASSAY
FUER
A-ARABINOFUERANOSIDASEAKTIVITAET
.
55
9.
PROTEINREINIGUNG
.
56
9
1
VORBEMERKUNG
.
56
9.2.
APPARATIVE
AUSSTATTUNG
.
57
9.3.
TRENNUNG
DURCH
ANIONEN-BZW
KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
57
9.4.
TRENNUNG
DURCH
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
(HIC)
.
58
9.5.
GELFILTRATION
.
59
9.5.1.
TRENNUNG
DURCH
GELFILTRATION
.
59
9.5.2.
MOLEKULARMASSENBESTIMMUNG
MIT
GELFILTRATION
.
59
9.6.
LAGERUNG
UND
REINIGUNG
DER
SAEULEN
.
60
10.
DAPI-FAERBUNG
.
60
C.
ERGEBNISSE
.
62
1.
ISOLIERUNG
DES
A-GLUCURONIDASEGENS
AUS
THERMOTOGA
MARITIMA
.
62
2.
RESTRIKTIONSKARTE
VON
PTAGU18
.
62
3.
DELETIONSSTUDIEN
.
64
4.
SOUTHERN-BLOT
ANALYSE
.
66
5.
SUBKLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
69
6.
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
.
71
6.1
RESTRIKTIONSKARTE
DES
GESAMTEN
SEQUENZIERTEN
BEREICHS
.
71
6.2.
OFFENE
LESERAHMEN
.
72
6.2.1.
ORF1
.
75
6.2.2.
ORF2
.
82
7.
BESTIMMUNG
DES
NHJ-TERMINUS
.
84
8.
KLONIERUNG
VON
AGUA
IN
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
84
8.1.
EXPRESSIONSSYSTEM
PT7-7
.
85
8.2.
EXPRESSIONSSYSTEM
PET-15B
.
87
9.
INDUKTIONSSTUDIEN
MIT
DEN
EXPRESSIONSSYSTEMEN
.
L
.
.
90
10.
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
REKOMBINANT
EXPRIMIERTEN
A-GIUCURONIDASE
92
10.1.
NICHT
EINSETZBARE
REINIGUNGSMETHODEN
.
92
10.1.1.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
92
10
1.2.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
93
10.1.3.
GELFILTRATION
.
93
10.2.
ERFOLGREICHE
REINIGUNGSMETHODE
.
93
10.2.1.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
UND
ROHEXTRAKTHERSTELLUNG
.
93
10.2.2.
ANREICHERUNG
DURCH
HITZEFAELLUNG
.
94
10.2.3.
GELFILTRATION
.
94
10
3.
EINFLUSS
VON
SALZ
AUF
DAS
REINIGUNGSVERHALTEN
.
96
10.4.
PH-OPTIMUM
.
97
10.5
"
TEMPERATUROPTIMUM
"
.
98
10.6.
THERMOSTABILITAET
.
99
10.7.
ISOELEKTRISCHER
PUNKT
.
101
10.7.1.
EXPERIMENTELLE
BESTIMMUNG
.
101
10.7.2.
THEORETISCHE
BESTIMMUNG
.
102
10.8.
EINFLUESSE
VERSCHIEDENER
REAGENZIEN
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
A-GHICURONIDASE
.
103
10.9
KINETISCHE
DATEN
.
104
10.10.
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
106
10.10.1.
HARTHOLZXYLAN
.
108
10.102.
WEICHHOLZXYLAN
.
112
10.10.3.
STROHXYLAN
.
113
10.104.
STROHXYLAN,
YYSTEAM
EXPLOSION
"
.
118
10.10.5.
DMSO-XYLAN
(BUCHE)
.
119
10.11.
SUBSTRATSPEZIFITAT
DER
A-GLUCURONIDASE
.
119
11.
INDUKTION
DER
ENZYME
DES
XYLANOLYTISCHEN
SYSTEMS
BEI
T.MARITIMA
.
127
12.
WACHSTUM
VON
T.MARITIMA
MIT
GLUCURONSAEURE
ALS
C-QUELLE
.
128
D.
DISKUSSION
.
130
E.
ZUSAMMENFASSUNG
.
145
F.
LITERATURVERZEICHNIS
.
147 |
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