Entwicklung und Validierung von Methoden zur Bestimmung des Polyamingehaltes und der Ornithindecarboxylase-Aktivität in gastrointestinalen Tumoren:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
|
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I
INHALTSVERZEICHNIS
L
EINLEITUNG
.
1
1.
POLYAMINE
.
1
1.1
EINFUEHRUNG
.
1
1.2
SYNTHESE
UND
INTERKONVERSION
(METABOLISMUS)
DER
POLYAMINE
.
2
1.3
KATABOLISMUS
DER
POLYAMINE
.
5
1.3
REGULATION
DES
POLYAMINMETABOLISMUS
.
6
2.
ORNITHINDECARBOXYLASE
.
8
2.1
POSITIVE
REGULATION
DER
ODC
.
8
2.1
NEGATIVE
REGULATION
DER
ODC
.
9
3
BEDEUTUNG
DER
POLYAMINE
FUER
DEN
ZELLSTOFFWECHSEL
.
11
3.1
POLYAMINE
UND
ZELLWACHSTUM
.
11
3.2
POLYAMINE
UND
ZELLDIFFERENZIERUNG
.
13
4.
BEDEUTUNG
DER
POLYAMINE
IN
DER
KARZINOGENESE
.
14
II.
PROBLEMSTELLUNG
.
15
III.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
16
1.
ENTWICKLUNG
EINER
RP-HPLC-METHODE
ZUR
TRENNUNG
DER
POLYAMINE
UND
IHRER
MONOACETYLDERIVATE
.
16
1.1
SYNTHESE
VON
N-HYDROXYSUCCINIMIDYL-6-CHINOLYLCARBAMAT
(HSQC)
.17
1.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
FLUORESZIERENDEN
CHINOLYLAMINOCARBONYL
(QAC)-DERIVATE
.18
1.2.1
SYNTHESE
VON
QAC-POLYAMINDERIVATEN
.
19
1.2.2
BESTIMMUNG
DES
MOLAREN
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
UND
DER
QUANTENAUSBEUTE
.
21
1.2.2.1
MOLARER
EXTINKTIONSKOEFFIZIENT
.
21
1.2.2.2
QUANTENAUSBEUTE
.
24
1.3
DENVATISIERUNG
DER
FREIEN
UND
DER
ACETYLIERTEN
POLYAMINE
.
31
1.3.1
EINFLUSS
DES
PUFFERS
UND
DES
PH-WERTES
AUF
DIE
DENVATISIERUNG
.
32
1.3.2
MOLARES
VERHAELTNIS
DER
REAKTIVEN
AMINOGRUPPEN
ZU
HSQC
.
35
1.4
STABILITAET
DER
FLUORESZIERENDEN
DENVATE
.
37
1.5
CHROMATOGRAPHISCHES
VERHALTEN
DER
DERIVATISIERTEN
POLYAMINE
.
37
II
INHALTSVERZEICHNIS
1.5.1
EINFLUSS
VON
METHANOL
ALS
BESTANDTEIL
DER
MOBILEN
PHASE
UND
DER
SAEULENOFENTEMPERATUR
AUF
DIE
PEAKSEPARATION
.
38
1.5.2
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
DER
MOBILEN
PHASE
AUF
DIE
PEAKSEPARATION
UND
DIE
PEAKFLAECHEN
.
41
1.5.2.1
METHODE
1:
VOLLSTAENDIGE
SEPARATION
DER
UNKONJUGIERTEN
UND
DER
ACETYLIERTEN
POLYAMINE
.
41
1.5.2.2
METHODE
2:
ERHOEHTE
SENSITIVITAET
OHNE
SEPARATION
VON
N
'
/N
'
-ACETYISPERMLDINDERIVATEN
.
47
1.5.3
CHARAKTERISIERUNG
AUFTRETENDER
INTERFERENZPRODUKTE
.
51
1.6
VALIDIERUNG
DER
HPLC-METHODE
.
55
1.7
BESTIMMUNG
DER
RECOVERY
.
58
1.8
BESTIMMUNG
DER
NICHT
KONJUGIERTEN
UND
DER
ACETYLIERTEN
POLYAMINE
AUS
ZELLKULTUR
UND
GEWEBEHOMOGENATEN
.
59
1.9
EXTRAKTION
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STABILITAET
VON
ACETYLIERTEN
POLYAMINEN
GEGENUEBER
TRICHLORESSIGSAEURE
.
63
1.10
DISKUSSION
1
.
65
2.
BESTIMMUNG
DER
OMITHINDECARBOXYLASE
(ODC)-AKTIVITAET
.
70
2.1
ODC-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DURCH
'
4
CO
2
MESSUNG
(RADIOAKTIV)
.
70
2.1.1
UNTERSUCHUNG
UND
OPTIMIERUNG
DER
ODC-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
71
2.1.1.1
FIXIERUNG
VON
,4
CO
2
.
71
2.1.1.2
FREISETZUNG
VON
U
CO
2
.
73
2.1.1.3
EINFLUSS
DES
PUFFERS
AUF
DIE
ODC-AKTIVITAET
.
76
2.1.2
VALIDIERUNG
DER
(
"
CO
2
)
ODC-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
76
2.2
ODC-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DURCH
PUTRESCIN-MESSUNG
MITTELS
HPLC
.
78
2.2.1
ENTWICKLUNG
EINES
REAKTIONSANSATZES
FUER
DIE
HPLC
BESTIMMUNG
.
78
2.2.2
VALIDIERUNG
DER
ODC-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
MITTELS
HPLC
.
79
2.2.3
MESSUNG
DER
ODC-AKTIVITAET
AUS
ZELLKULTURMATERIAL
.
82
2.3
DISKUSSION
II
.
83
3.
BESTIMMUNG
DER
ODC-AKTIVITAET
UND
DER
POLYAMINGEHALTE
HUMANER
KOLOREKTALER
KARZINOME
-
KORRELATION
MIT
STAGING,
GRADING
UND
TUMORMARKERN
.
87
3.1
EINFLUSS
DER
PROBENGEWINNUNG
AUF
DIE
ODC-AKTIVITAET
UND
DEN
POLYAMINGEHALT
.
87
3.2
ODC-AKTIVITAET
UND
POLYAMINGEHALTE
HUMANER
KOLOREKTALER
KARZINOME
.91
3.3
KORRELATION
MIT
DER
TNM-KLASSIFLKATION
.
94
3.4
KORRELATION
MIT
DEN
TUMORMARKERN
CEA
UND
CA
19-9
.
97
3.5
DISKUSSION
III
.
99
4.
ZELLKULTUR
UND
NACKTMAUS-MODELL
DREIER
UNTERSCHIEDLICH
DIFFERENZIERTER
DUKTALER
PANKREASKARZINOME
.
101
4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
DUKTALEN
PANKREASKARZINOMZELLINIEN
.
102
4.1.1
MORPHOLOGIE
.
102
4.1.2
KARYOTYPISIERUNG
.
105
4.1.3
PROLIFERATIONSVERHALTEN
.
107
4.1.3.1
KRISTALLVIOLETT-ASSAY
IN
MIKROTITERPLATTEN
.
108
4.1.3.2
KORRELATION
ZELLZAHL
/
PROTEINGEHALT
.
YY.
.
112
4.1.4
IMMUNZYTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
BEZUEGLICH
URSPRUNG
UND
DIFFERENZIERUNGSGRAD
.
114
4.1
4
1
AUSTESTEN
DER
ANTIKOERPER
AM
HUMANEN
PANKREASGEWEBE
.
115
4.1
4
2
HUMANE
PANKREASKARZINOM-ZELLINIEN
.
117
4.2
ODC-AKTIVITAET
UND
POLYAMINGEHALT
.
119
4
2.1
PROLIFERATIONSEXPERIMENTE
.
119
4.2.2
ERSTELLEN
DER
KORRELATION
ZELLVOLUMEN
/
PROTEINGEHALT
UND
BERECHNUNG
DER
MOLAREN
INTRAZELLULAEREN
POLYAMINKONZENTRATION
.
123
4
3
BESTIMMUNG
DER
CARBOANHYDRASE-AKTIVITAET
.
YY.
.
124
4
3
1
ENTWICKLUNG
EINES
MIKROTITERPLATTEN-ASSAY
.
125
4.3.2
BESTIMMUNG
DER
CARBOANHYDRASE-AKTIVITAETEN
INNERHALB
EINES
PROLIFERATIONS
EXPERIMENTES
.
127
4.4
BESTIMMUNG
DER
A-AMYLASE-AKTIVITAET
.
129
4.4.1
ENTWICKLUNG
EINES
MIKROTITERPLATTEN-ASSAYS
.
129
4
4.2
BESTIMMUNG
DER
A-AMYLASE-AKTIVITAET
INNERHALB
EINES
PROLIFERATIONS
EXPERIMENTES
.
131
4
5
WACHSTUM
DER
TUMORZELLEN
IN
NACKTMAEUSEN
.
132
4.5.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
IN
VIVO
GEWACHSENEN
PANKREASTUMORE
.
132
4.5.2
BESTIMMUNG
DER
ODC-AKTIVITAET,
DES
POLYAMINGEHALTS,
DER
CARBOANHAYDRASE
UND
DER
A-AMYLASE-AKTIVITAET
DER
IN
VIVO
GEWACHSENEN
PANKREASTUMORE
.
134
4.6
SPEZIFISCHE
INHIBITOREN
DES
POLYAMINMETABOLISMUS
.
135
4
7
DISKUSSION
IV
.
143
IV.
ZUSAMMENFASSUNG
.
146
V.
EXPERIMENTELLER
TEIL
.
149
1.
ALLGEMEINE
ANGABEN
.
149
1.1
GERAETE
UND
MATERIALIEN
.
149
1.1.1
SPEKTROSKOPIE
.
149
IV
INHALTSVERZEICHNIS
1.1.2
ANALYTIK
.
151
1.1.3
MIKROSKOPIE
.
152
1.1.4
WEITERE
GERATE
UND
MATERIALIEN
.
152
1.1.5
LAYOUT
UND
STATISTIK
.
153
1.2
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
.
153
2.
SYNTHESE
.
155
2.1
N-HYDROXYSUCCLNLMLDYL-6-CHLNOLYLCARBAMAT
(HSQC)
.
155
2.2
POLYAMINDERIVATE
.
156
2.2.1
N
'
.N
'
-BISFSS-CHINOLYLAMINOCARBONYOPUTRESCIN
.
156
2.2.2
N
'
,N
'
-BIS(6-CHINOLYLAMINOCARBONYL)CADAVERIN
.
157
2.2.3
N
'
,N
7
-BIS(6-CHINOLYLAMINOCARBONYL)-1,7-DIAMINOHEPTAN
.
158
2.2.4
N
'
,N
4
,N'-TRIS(6-CHINOLYLAMINOCARBONYL)SPERMLDIN
.
159
2.2.5
N',N
4
,N
'
,N'
2
-TETRAKLS(6-CHINOLYLAMINOCARBONYL)SPERMIN
.
160
2.3
S-ADENOSYLMETHIONLNDECARBOXYLASE-INHIBITOR
DIETHYLGLYOXAL-BLS(AMIDINOHYDRAZON)
161
3.
BETRIEBSBEDINGUNGEN
DER
HPLC-METHODE
.
163
3.1
STATIONAERE
PHASE
.
163
3.2
MOBILE
PHASE
.
163
3.3
PROBENVORBEREITUNG
UND
DERIVATISIERUNG
.
164
3.3.1
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
AUS
BIOLOGISCHEM
MATERIAL
.
164
3.3.1.1
ZELLKULTURMATERIAL
.
164
3.3.1.2
GEWEBEMATERIAL
.
164
3.3.2
DERIVATISIERUNG
.
165
3.4
KALIBRIERSTANDARD
UND
EICHUNG
DER
HPLC
.
166
3.5
BESTIMMUNG
DER
QUANTENAUSBEUTE
DER
PRAEPARATIV
DARGESTELLTEN
QAC-POLYAMINE.
166
3.5.1
ABSORPTIONSSPEKTREN
.
167
3.5.2
BESTIMMUNG
DES
MOLAREN
DEKADISCHEN
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
.
169
3.5.3
AUFZEICHNUNG
UND
KORREKTUR
DER
EMISSIONSSPEKTREN
.
169
4.
ENZYMAKTIVITAETSTESTS
.
172
4.1
OMITHINDECARBOXYLASE
.
172
4.1.1
ODC-AKTMTAETSASSAY
(
'
4
CO
2
)
.
172
4.1.1.1
ODC-AKTIVITAETSMESSUNG
.
172
4.1.1.2
BESTIMMUNG
DER
QUENCHKORREKTURKURVE
.
174
4.1.1.3
BERECHNUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
.
175
4.1.2
BESTIMMUNG
DER
ODC-AKTIVITAET
DURCH
QUANTIFIZIERUNG
VON
PUTRESCIN
.
176
4.2
CARBOANHYDRASE
II
.
176
4.3A-AMYLASE
.
178
INHALTSVERZEICHNIS
V
5
KULTIVIERUNG
DER
ZELHMEN
.
180
6.
FAERBUNGEN
.
181
6.1
HERSTELLEN
VON
GEWEBESCHNITTEN
.
181
6.1.1
GEFRIERSCHNITTE
.
181
612
PARAFFINSCHNITTE
.
181
6.2
HAEMALAUN
EOSM-FAERBUNG
.
182
6
3
GIEMSA-FAERBUNG
.
182
6
4
KERNFAERBUNG
MIT
MAYERS
HAEMALAUN
.
182
7.
IMMUNZYTOCHEMISCHE
UND
-HISTOCHEMISCHE
FAERBUNGEN
.
183
7
1
PRINZIP
DER
FAERBUNGEN
.
183
7
2
PRAKTISCHE
DURCHFUEHRUNG
.
184
8.
KARYOTYPISIERUNG
.
186
8
1
CHROMOSOMENPRAEPARATION
.
186
8
2
CHROMOSOMENZAEHLUNG
.
186
9.
ZELLVOLUMEN
UND
PROTEINGEHALT
DER
KULTIVIERTEN
ZELLEN
.
187
9.1
BESTIMMUNG
DER
ZELLVOLUMINA
.
187
9
2
ZELLZAHLBESTIMMUNG
.
187
9
3
ZUSAMMENHANG
ZWISCHEN
PROTEINGEHALT
UND
ZELLVOLUMEN
.
188
10
ERMITTLUNG
DER
ZELLMASSE
MIT
DEM
KRISTALLVIOLETT
-
ASSAY
.
189
11.
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
.
191
11.1
BESTIMMUNG
NACH
DEM
BCA-VERFAHREN
.
191
11.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
192
12.
VERSUCHE
MIT
NACKTMAEUSEN
.
193
13.
KORRELATIONSSTUDIEN
ZUM
KOLOREKTALEN
KARZINOM
.
193
ANHANG
.
195
PUBLIKATIONEN
.
202
LITERATURVERZEICHNIS
.
219
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