Funktion von Fc gamma RII-Isoformen in B-Zellen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG.
1
1.1
B-LYMPHOZYTEN.
1
1.1.1
ENTWICKLUNG
UND
SELEKTION
VON
B-ZELLEN
.
3
1.1.2
BCR
INDUZIERTE
SIGNALTRANSDUKTION
IN
B-ZELLEN
.
4
1.1.3
INHIBITION
DER
BCR
VERMITTELTEN
B-ZELLAKTIVIERUNG
DURCH
FC-REZEPTOREN.
9
1.1.4
ENDOZYTOSE
UND
ANTIGENPRAESENTATION
IN
B-ZELLEN.
14
2.
PROBLEMSTELLUNG.
17
3.
ZUSAMMENFASSUNG.
19
4.
MATERIAL
.
21
4.1
ZELLINIEN
.
21
4.2
E.COLI
BAKTERIENSTAEMME.
21
4.3
PLASMIDE
.
22
4.4
CDNAS
.
22
4.5
OLIGONUKLEOTIDE
.
23
4.6
REKOMBINANTE
PROTEINE.23
4.7
ANTIKOERPER
.23
4.8
ENZYME.
24
4.9
CHEMIKALIEN
.
24
4.10
PUFFER,
MEDIEN
UND
LOESUNGEN.
24
4.11
GERAETE
.26
4.12
SONSTIGE
MATERIALIEN
.27
5.
METHODEN.28
5.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.28
5.1.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID
DNA
IM
KLEINEM
MASSSTAB
.28
5.1.2
GROSSISOLIERUNG
VON
PLASMID
DNA
UEBER
CSCI-GRADIENTEN.29
5.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
VON
NUKLEINSAEUREN
.
29
5.1.4
HYDROLYSE
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.
29
5.1.5
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
29
5.1.6
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN.
29
5.1.7
HERSTELLUNG
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.COLI
.
30
5.1.8
TRANSFORMATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.COLI
.
30
5.1.9
DNA-SEQUENZIERUNG.
30
5.1.10
GERICHTETE
MUTAGENESE.
32
5.2
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN.
33
5.2.1
BESTIMMUNG
DER
ZEITZAHL
.
33
5.2.2
MEDIENWECHSEL
UND
TEILUNG
VON
KULTURZELLEN
.
33
5.2.3
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
.
34
5.2.4
STABILE
TRANSFEKTION
VON
BHK-21-ZELLEN
MITTELS
KALZIUMPHOSPHAT-PRAEZIPITATION.
34
5.2.5
STABILE
TRANSFEKTION
VON
IIA1.6-ZELLEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
35
5.2.6
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
OBERFLAECHENFLUORESZENZ
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
35
5.2.7
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
FCR
VERMITTELTEN
ENDOZYTOSE
VON
AHLGGS
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
.
37
5.2.8
QUALITATIVE
BESTIMMUNG
DER
FCR
VERMITTELTEN
ENDOZYTOSE
VON
AHLGG
DURCH
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
.
38
5.2.9
ANALYSE
DES
INTRAZELLULAEREN
KALZIUMFLUSSES
AN
TRANSFIZIERTEN
IIA1.6-ZELLEN
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
.
38
5.2.10
ISOLIERUNG
VON
HUMANEN
THROMBOZYTEN
.
39
5.2.11
ISOLIERUNG
TONSILLAERER
HUMANER
B-ZELLEN
.
39
5.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
40
5.3.1
PRAEPARATION
VON
FITC-MARKIERTEN
HLGG
.
40
5.3.2
HERSTELLUNG
AGGREGIERTER
HLGG
.
41
5.3.3
PROTEINFAELLUNG
.
41
5.3.4
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
.
41
5.3.5
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
42
5.3.6
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
42
5.3.7
WESTERN
BLOT
.
43
5.3.8
"STRIPPING"
VON
WESTERN
BLOTS
.
43
5.3.9
IMMUNPRAEZIPITATION
UND
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
FCRII
AUS
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
.
43
5.3.10
EPITOP-BESTIMMUNG
MITTELS
UEBERLAPPENDER
PEPTIDE
.
44
5.3.11
INDUKTION
UND
NACHWEIS
DER
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
FCRII
UND
IGM-LGSS
.
45
5.3.12
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
HISE-FUSIONSPROTEINEN
AN
NICKEL
NTA-SEPHAROSE
.
46
5.3.13
IN
VITRO
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
ZYTOPLASMATISCHEN
DOMAENEN
DER
FCRII-LSOFORMEN
.
46
6.
ERGEBNISSE
.
47
6.1
CHARAKTERISIERUNG
UND
EPITOPBESTIMMUNG
DER
MAK
II1A5
UND
II8D2
.
47
6.1.1
ANALYSE
DER
BINDUNGSSPEZIFITAETEN
VON
DEN
MAK
111
A5
UND
II8D2.
47
6.1.2
EPITOPBESTIMMUNG
DER
MAK
111
A5
UND
II8D2
.
52
6.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
FUER
DIE
ENDOZYTOSE
VON
LOESLICHEN
IMMUN
KOMPLEXEN
ESSENTIELLEN
SEQUENZMOTIVS
VON
FCRIIA/C
IN
B-ZELLEN
.
56
6.2.1.
HERSTELLUNG
DER
TYROSINAUSTAUSCHMUTANTEN
FCRIIA/C
F298,
-F282
UND
-F275
.
58
6.2.2
EXPRESSION
VON
FCRILA
WILDTYP
UND
FCRILA
DELETIONS
UND
TYROSINAUSTAUSCHMUTANTEN
IN
DER
B-ZELLINIE
IIA1.6.
59
6.2.3
QUANTITATIVE
UNTERSUCHUNG
DER
FCRILA
VERMITTELTEN
ENDOZYTOSE
VON
LOESLICHEN
IMMUNKOMPLEXEN
IN
IIA1.6
ZELLEN
IM
VERGLEICH
ZU
DER
FCRLLB2
VERMITTELTEN
ENDOZYTOSE.
61
6.2.4
IDENTIFIZIERUNG
DES
ENDOZYTOSE-VERMITTELNDEN
SEQUENZBEREICHES
IN
DER
ZYTOPLASMATISCHEN
DOMAENE
VON
FCRILA
.
62
6.2.5
NACHWEIS
DER
ENDOZYTOSE
VON
AHLGG
IN
B-ZELLEN
DURCH
IMMUN
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
.
64
6.2.6
UNTERSUCHUNG
DER
FCRILA
VERMITTELTEN
ENDOZYTOSE
VON
IMMUN
KOMPLEXEN
IN
BHK-21
ZELLEN
.
66
6.3
UNTERSUCHUNG
ZUR
FCRIIA/C,
-B1
UND
-B2
VERMITTELTEN
INHIBITION
DER
B-ZELLAKTIVIERUNG.
68
6.3.1
EXPRESSION
DES
IGM-LGSS-ANTIGENREZEPTORS
IN
DIE
FCRILBL,
-B2,
-A/C
EXPRIMIERENDEN
IIA1.6
ZELLEN
.
68
6.3.2
INHIBITION
DES
ANTIGENREZEPTOR
INDUZIERTEN
KALZIUMIONENEINSTROMS
NACH
CO-QUERVERNETZUNG
MIT
DEN
VERSCHIEDENEN
FCRII
ISOFORMEN
.
71
6.3.3
ANALYSE
DER
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
IGM-LGSS
UND
FCRII
NACH
QUERVERNETZUNG
UND
CO-QUERVERNETZUNG
DES
CHIMAEREN
ANTIGENREZEPTORS
.
74
6.3.4
COPRAEZIPITATION
DER
TYROSINPHOSPHATASE
SHP-1
MIT
DEM
TYROSIN-
PHOSPHORYLIERTEN
FCRILBL
AUS
IIA1
.6
ZELLEN
.
TI
6.3.5
ANALYSE
DER
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
BCR
ASSOZIIERTEN
TYROSINKINASEN
.
79
7.
DISKUSSION.
81
7.1
MIT
HILFE
DER
MAK
II1A5
UND
II8D2
KOENNEN
FCRII
ISOFORMEN
UNTERSCHIEDEN
WERDEN
.
81
7.2
FCRIIA/C
VERMITTELT
IN
B-ZELLEN
ENDOZYTOSE
VON
IMMUNKOMPLEXEN.
84
7.3
DIE
FCRII
ISOFORMEN
BESITZEN
IN
B-ZELLEN
EIN
UNTERSCHIEDLICHES
POTENTIAL,
DIE
B-ZELLAKTIVIERUNG
ZU
INHIBIEREN
.
91
8.
LITERATURVERZEICHNIS.
101
9.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
120 |
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