Endothelzell-Laminine: molekulare und funktionelle Aspekte
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
L
ZUSAMMENFASSUNG
1
II.
EINLEITUNG
3
III.
MATERIAL
21
1.
CHEMIKALIEN
21
2.
ENZYME
21
3.
KITS
21
4.
RADIOISOTOPE
22
5.
BAKTERIENSTAEMME
22
6.
DNA-VEKTOREN
22
7.
LAENGEN
UND
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
22
8.
MEDIEN
FUER
DIE
BAKTERIENKULTUR
23
9.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
23
10.
ANTIKOERPER
24
11.
MATRIX-PROTEINE
25
12.
ARGININ-GLYCIN-ASPARAGINSAEURE-PEPTIDE
(RGD-PEPTIDE)
25
13.
OLIGONUKLEOTIDE
UND
ANNEALINGTEMPERATUR
DER
PRIMER
26
14.
COMPUTERPROGRAMME
ZUR
SEQUENZANALYSE
27
15.
MAUS-STAEMME
UND-EMBRYOS
27
16.
VERWENDETE
ZELLEN
27
16.1.
MAUS-ENDOTHELZELLINIEN
27
16.2
PMN
UND
LEUKOZYTEN-ZELLINIEN
28
IV.
METHODEN
29
1.
ZELLKULTUR
29
1.1.
ENDOTHELZELLEN
29
1.2.
PMN
UND
LEUKOZYTEN-ZELLINIEN
29
1.3.
ISOLIERUNG
VON
NEUTROPHILEN
GRANULOZYTEN
(PMN)
29
2.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
30
2.1.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
30
3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
30
3.1.
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
30
3.2.
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
31
3.3.
ISOLATION
VON
MRNA
31
3.4.
ERSTSTRANG
CDNA
SYNTHESE
31
3.5.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
31
3.6.
ELUTION
VON
CDNA
AUS
AGAROSEGELEN
32
3.7.
RESTRIKTIONSVERDAU
UND
SUBKLONIERUNG
32
3.7.1.
SUBKLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
32
3.7.2.
SUBKLONIERUNG
VON
XGTLO-DNA-FRAGMENTEN
32
3.7.3.
SUBKLONIERUNG
VON
PLASMID-CDNA-FRAGMENTEN
33
3.8.
ISOLATION
VON
PLASMID-DNA
33
3.9.
SCREENING
DER
XGTLO
PHAGEN-CDNA-GENBANKEN
33
3.91.
GENBANKEN
33
3.9.2.
AUSPLATTIEREN
DER
PHAGEN
33
3.9.3.
SCREENING
34
3.9.4.
AUFREINIGUNG
DER
PHAGEN-DNA
35
3.10.
5'-PRIME-RACE
36
3.11.
SEQUENZIERUNG
37
3.12.
NORTHERN-BLOT
37
3.13.
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
(ISH)
37
4.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
38
4.1.
IMMUNPRAEZIPITATION
38
4.2.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
38
5.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
39
5.1.
ZELL-ADHAESIONSTEST
39
5.2.
INHIBITIONS-EXPERIMENTE
ZUR
ZELLBINDUNG
AN
DIE
KOMPONENTEN
DER
ECM
40
5.2.1.
INHIBITIONSEXPERIMENTE
MIT
ANTIKOERPERN
UND
RGD-PEPTIDEN
40
5.2.2.
ERDALKALI-FREIE
INHIBITIONSEXPERIMENTE
41
V.
ERGEBNISSE
42
1.
KLONIERUNG
DER
KOMPLETTEN
LAMA4-CDNA
42
1.1.
KLONIERUNGSSTRATEGIE
42
2.
STRUKTUR
DER
MAUS
LAMININ
A4-KETTE
44
2.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
EINZELNEN
DOMAENEN
46
2.1.1.
SIGNALPEPTID
46
2.1.2.
N-TERMINALE
DOMAENE
UND
DOMAENE
III
46
2.1.3.
DOMAENEN
I/II
47
2.1.4.
C-TERMINALE
GLOBULAERE
DOMAENE
G
48
2.1.5.
SONSTIGE
MERKMALE
49
2.1.5.1.
GLYKOSYLIERUNG
49
2.1.5.2.
RGD-BINDUNGSSTELLE
49
3.
HOMOLOGIE
UND
VERWANDTSCHAFT
DER
LAMININ
A4-KETTE
MIT
ANDEREN
LAMININ
A-KETTEN
50
4.
EXPRESSION
DER
LAMININ
A4-KETTEN
IN
ENDOTHELZELLEN
52
5.
LAMININ
A4-MRNA
EXPRESSION
IN
VIVO
53
5.1.
LAMININ
A4-MRNA-EXPRESSION
IN
ENDOTHELZELLEN
55
5.2.
LAMININ
A4-MRNA
EXPRESSION
IM
GEWEBE
55
6.
ADHAESION
VON
LEUKOZYTEN
AN
PROTEINE
DER
EXTRAZELLULAEREN
MATRIX
60
6.1.
ABSOLUTE
BINDUNG
AN
ECM-PROTEINE
60
6.2.
UNSPEZIFISCHE
BINUDNG
AN
BSA
UND
PLASTIK
62
6.3.
SPEZIFISCHE
BINDUNG
AN
ECM-PROTEINE
63
6.4.
BINDUNG
AN
LAMININ-ISOFORMEN
64
7.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZUR
MATRIXBINDUNG
VERWENDETEN
ZELLOBERFLAECHENREZEPTOREN
66
7.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
EXPRIMIERTEN
ZELLOBERFLAECHENREZEPTOREN
66
7.1.1.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
67
7.1.2.
IMMUNPRAEZIPITATION
70
7.1.3.
RT-PCR
72
8.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZUR
ECM-BINDUNG
VERWENDETEN
REZEPTOREN
73
8.1.
REZEPTOREN
ZUR
VITRONEKTINBINUNG
74
8.2.
REZEPTOREN
ZUR
FIBRONEKTINBINDUNG
75
8.3.
REZEPTOREN
ZUR
LAMININ-1
BINDUNG
77
8.4.
REZEPTOREN
ZUR
LAMININ-2
BINDUNG
77
8.5.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ZUR
MATRIXBINUNG
VERWENDETEN
INTEGRINE
80
VI.
DISKUSSION
81
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
100
ANHANG
1
116 |
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