Isolierung und Charakterisierung von filamentspezifisch exprimierten Genen aus Ustilago maydis:
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1996
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adam_text | ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON FILAMENTSPEZIFLSCH EXPRIMIERTEN
GENEN AUS USTILAGO MAYDIS DISSERTATION DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN RALPH BOHLMANN MUENCHEN, 1996
DIESE DISSERTATION WURDE AM 16.12.1996 AN DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE DER
LUDWIG- MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN ZUR BEURTEILUNG EINGEREICHT. DIE
BEGUTACHTUNG DER ARBEIT ERFOLGTE DURCH FRAU PROF. DR. KAHMANN
(ERSTGUTACHTER) UND DURCH HERRN PROF. DR. EBEL (ZWEITGUTACHTER). DIE
MUENDLICHE PRUEFUNG FAND AM 19.02.1997 STATT. INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 1 1.1 DIMORPHISMUS 1 1.2 DIMORPHISMUS
UND PATHOGENITAET 1 1.3 DIMORPHISMUS UND PATHOGENITAET IN USTILAGO MAYDIS
2 1.3.1 DER LEBENSZYKLUS VON U.MAYDIS 2 1.3.2 DIMORPHISMUS UND
PATHOGENITAET WERDEN DURCH ZWEI KREUZUNGSTYPLOCI REGULIERT 3 1.3.3 DER
A-KREUZUNGSTYPLOCUS VERMITTELT DIE FUSION VON ZELLEN 3 1.3.4 DER
6-KREUZUNGSTYPLOCUS LEITET DIE PATHOGENE ENTWICKLUNG EIN 4 1.3.5 DIE
GENE IN DEN A-UND ^-KREUZUNGSTYPLOCI WERDEN DURCH PRFL REGULIERT 6 1.4
ANSAETZE ZUR IDENTIFIZIERUNG VON GENEN, DIE AM PATHOGENITAETSPROZESS
BETEILIGT SIND 6 1.4.1 GENETISCHE ANALYSE VON DIMORPHISMUS UND
PATHOGENITAET IN U.MAYDIS 7 1.4.1.1 IDENTIFIZIERUNG VON
PATHOGENITAETSMUTANTEN INPLANTA 7 1.4.1.2 MORPHOLOGISCHE MUTANTEN IN
U.MAYDIS 8 1.4.2 IDENTIFIZIERUNG PFLANZENINDUZIERTER GENE 9 1.4.3
DIFFERENTIELLE GENEXPRESSION IM UEBERGANG VON DER HEFE- ZUR FILAMENTFORM
IN U.MAYDIS... 10 T 1.5 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT 13 2.
ERGEBNISSE 14 2.1 ISOLIERUNG STADIENSPEZIFISCH EXPRIMIERTER TRANSKRIPTE
MITTELS DIFFERENTIAL DISPLAY 14 2.2 CHARAKTERISIERUNG DER
FILAMENTSPEZIFLSCH EXPRIMIERTEN GENE 17 2.2.1 NUKLEINSAEURE- UND PUTATIVE
PROTEINSEQUENZ DER GENE DIKL, DIK2, DIK3 UND DIKOE 17 2.2.2 AEHNLICHKEITEN
ZU BEKANNTEN SEQUENZEN IN DER DATENBANK 22 2.3 EXPRESSIONSSTUDIEN VON
DIKL, HUM2, DIK3 UND DIKOE 24 2.3.1 ZEITLICHES MUSTER DER EXPRESSION AUF
AKTIVKOHLEHALTIGEN CM-PLATTEN 24 2.3.2 EXPRESSION IN ABHAENGIGKEIT VON
DEN KREUZUNGSTYPLOCI A UND B 26 2.3.3 EXPRESSION IN KREUZUNGEN VON
DELETIONSMUTANTEN DER IDENTIFIZIERTEN GENE 27 2.3.4 EXPRESSIONSANALYSEN
IN TUMORGEWEBE 28 2.4 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NULLMUTANTEN
DER GENE DIKL, HUML, DIK3 UND DIKOE. .30 2.4.1 SOUTHERNANALYSE DER
NULLMUTANTEN 31 2.4.2 WACHSTUM, KREUZUNGSVERHALTEN UND PATHOGENITAET DER
NULLMUTANTEN 33 2.5 EXPERIMENTE ZUR CHARAKTERISIERUNG VON HUNUE, EINEM
HYDROPHOBINGEN AUS U.MAYDIS 34 2.5.1 UEBEREXPRESSION VON HUML IN U.MAYDIS
34 2.5.2 VERSUCHE ZUR ISOLIERUNG VON HUM2 AUS U.MAYDIS 36 2.5.3 VERSUCHE
ZUR EXPRESSION VON HUM2 IN E.COLI 38 2.5.3.1 EXPRESSION VON HUM2 IM
PET-15B SYSTEM 38 INHALTSVERZEICHNIS 2.5.3.2 EXPRESSION VON HUM2 IM
PGEX-3X SYSTEM 38 2.5.4 VERSUCHE ZUR LOKALISIERUNG VON HUM2 IN U.MAYDIS
39 2.5.4.1 INSERTION EINES (LA) HAEM-EPITOPS IN DEN C-TERMINUS VON HUM2
40 2.5.4.2 VERSUCHE ZUM GENAUSTAUSCH VON HUML GEGEN HUMLLA 41 2.5.5 DIE
VERWENDUNG VON SGFP ALS REPORTER 44 2.5.5.1 ERSTELLEN DES SGFP
REPORTERGENKONSTRUKTS 44 2.5.5.2 EXPRESSION DES SGFP
REPORTERGENKONSTRUKTS 45 2.5.6 EXPRESSION VON HUML UNTER DER KONTROLLE
DES REPL PROMOTORS 48 2.5.6.1 HERSTELLUNG EINES KONSTRUKTS, BEI DEM REPL
DURCH HUML ERSETZ T WIRD 48 2.5.6.2 NACHWEIS DER EXPRESSION VON HUML
UNTER DER KONTROLLE DES REPL PROMOTORS 51 3. DISKUSSION 54 3.1
FILAMENTSPEZIFLSCH EXPRIMIERTE GENE IN DEM PFLANZENPATHOGENEN, 1
DIMORPHEN PILZ U.MAYDIS 54 3.2 FUNKTION DER FILAMENTSPEZIFISCHEN GENE
DIKL, HUML AND DIKOE 55 3.3 DAS FILAMENTSPEZIFISCHE GEN DIKL 55 3.4 DAS
FILAMENTSPEZIFISCHE GEN DIKOE 57 3.5 DAS FILAMENTSPEZIFISCHE GEN HUML .
58 3.5.1 HUM2 GEHOERT ZU EINER GRUPPE KLEINER, CYSTEINREICHER PROTEINE 59
3.5.2 KLEINE, CYSTEINREICHE, SEKRETIERTE PROTEINE IN PHYTOPATHOGENEN
PILZEN 60 3.5.3 FUNKTION VON HUM2, EINEM HYDROPHOBIN AUS U.MAYDIS 62 3.6
DIE EXPRESSION UND REGULATION DER GENE DIKL, HUML, DIK3 UND DIKOE 65 3.7
BEZIEHUNG ZWISCHEN EXPRESSION ( STADIENSPEZIFISCHER GENE, DIMORPHISMUS
UND PATHOGENITAET IN PATHOGENEN PILZEN 67 3.8 AUSBLICK 69 4. MATERIAL UND
METHODEN 70 4.1 MATERIALIEN 70 4.1.1 VERWENDETE MAISVARIETAETEN, E.COLI
UND U.MAYDIS STAEMME 70 4.1.2 IN DIESER ARBEIT VERWENDETE DNA VEKTOREN 71
4.1.3 XGTLO CDNA BANK DES STAMMES FBD11 74 4.1.4 COSMIDBIBLIOTHEK DES
STAMMES FBD11 74 4.1.5 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE FUER DIFFERENTIAL
DISPLAY UND WEITERE AMPLIFIKATIONEN 75 4.1.6 VERWENDETE MEDIEN UND
LOESUNGEN 75 4.2 MIKROBIOLOGISCHE UND GENETISCHE METHODEN 76 4.2.1
ANZUCHTBEDINGUNGEN VON E.COLI UND U.MAYDIS 76 4.2.2 TEST AUF
KOMPATIBILITAET DERA UND B ALLELE 76 INHALTSVERZEICHNIS 4.2.3 INFEKTION
VON MAISPFLANZEN (PATHOGENITAETSTEST) 76 4.2.4 TRANSFORMATION VON E.COLI
UND U.MAYDIS 77 4.2.5 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 77 4.2.5.1
PRAEPARATION VON PLASMID DNA AUS E.COLI 77 4.2.5.2 PRAEPARATION VON DNA
AUS XGUEOPHAGEN 77 4.2.5.3 PRAEPARATION VON CHROMOSOMALER DNA AUS U.MAYDIS
78 4.2.5.4 PRAEPARATION VON GESAMT RNA 78 4.2.6 MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITEN AN ISOLIERTER DNA 78 4.2.6.1 MODIFIKATION UND RESTRIKTION VON
NUKLEINSAEUREN 78 4.2.6.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG UND ISOLIERUNG
VON DNA AUS AGAROSEGELEN 78 4.2.6.3 AUFTRENNUNG VON DNA FRAGMENTEN IN
DENATURIERENDEN POLYACRYLAMID-HARNSTOFFGELEN 78 4.2.6.4 SEQUENZIEREN
DOPPELSTRAENGIGER DNA MOLEKUELE 79 4.2.6.5 SEQUENZANALYSE DER GENE DIKL,
HUML, DIKI UND DIKOE 79 4.2.6.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA FRAGMENTEN
80 4.2.7 TRANSFER UND ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN AUF NYLONMEMBRANEN 81
4.2.7.1 ANALYSE VON DNA ( SOUTHERN BLOT ) : 81 4.2.7.2 ANALYSE VON RNA
( NORTHERN BLOT ) 81 4.2.7.3 VERWENDUNG DER PEPTIDYL PROLYL ISOMERASE
(PPIL) AUS U.MAYDIS ALS SONDE 81 4.2.7.4 IDENTIFIZIERUNG VON PLASMIDEN
DURCH KOLONIEHYBRIDISIERUNG 81 4.2.7.5 IDENTIFIZIERUNG VON CDNA
ENTHALTENDEN .GTLO-PHAGEN 82 4.2.7.6 IDENTIFIZIERUNG VON COSMIDEN 82
4.2.8 DIE TECHNIK DES DIFFERENTIAL DISPLAY 82 4.2.8.1 SYNTHESE DER
CDNA 82 4.2.8.2 PCR AUS CDNA SUBPOPULATIONEN UND DEREN
ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG 83 4.2.8.3 ELUTION UND AMPLIFIKATION VON
DNA FRAGMENTEN AUS POLYACRYLAMIDGELEN 83 4.2.8.4 KLONIEREN VON PCR
FRAGMENTEN 84 4.2.9 ERSTELLUNG VON DELETIONSKONSTRUKTEN FUER DIE GENE
DIKL, HUML, DIKI UND DIKOE 84 4.3 PROTEINCHEMISCHE ARBEITEN 84 4.3.1
VERSUCHE ZUR ISOLIERUNG VON HUM2 AUS U.MAYDIS 84 4.3.2 ARBEITEN MIT DEN
EXPRESSIONSSYSTEMEN PET-15B UND PGEX-3X 85 4.3.3 SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 85 4.3.4 NACHWEIS DES
HAEMAGGLUTININMARKIERTEN HYDROPHOBINS HUM2LA 85 4.4 VERWENDETE
ABKUERZUNGEN 86 5. ZUSAMMENFASSUNG 87 6. LITERATURVERZEICHNIS 88
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