Untersuchungen zur Immunpathogenese der Wegenerschen Granulomatose, Endothelzellen als Zielstruktur von Antikörpern gegen Proteinase-3:
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1992
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
SEITE
1.1. DAS KRANKHEITSBILD DER WEGENERSCHEN GRANULOMATOSE
6
1.2. KRANKHEITSSTVPISCHE ANTIKOERPER BEI DER WEGENERSCHEN
GRANULOMATOSE 7
1.3. ANCA-ZIELANTIEENE
10
1.3.1. PROTEINASE 3
1.3.2. MYELOPEROXIDASE
1.3.3. SELTENE ANCA-ANTIGENE
1.4. HISTOPATHOLORISCHE BESONDERHEITEN ANCA-ASSOZIIERTER
VASKULITIDEN 12
2. PROBLEMSTELLUNG
14
3. SERUMKOLLEKTIV
15
3.1. PATIENTEN MIT WEGENERSCHER GRANULOMATOSE
15
3.2. KONTROLLGRUPPE 17
3.2.1. PATIENTEN MIT SYSTEMISCHEM LUPUS ERYTHEMATODES
3.2.2. PATIENTEN MIT CHRONISCHER POLYARTHRITIS
3.2.3. PATIENTEN MIT SHARP-SYNDROM
3.2.4. PATIENTEN MIT SJOEGREN-SYNDROM
3.2.5. PATIENTEN MIT M. BECHTEREW
3.2.6. GESUNDE BLUTSPENDER
4. METHODEN
19
4.1. SCREENINPMETHODEN ZUR EVALUIERUNG DES SERUMKOLLEKTIVES
19
4.1.1. UEBERWANDERUNGSELEKTROPHORESE
4.1.2. DOPPELDIFFUESIONSTEST NACH OUCHTERLONY
4.1.3. KRYOESTATSCHNITTE
4.1.4. IMMUNFLUORESZENZ AUF HEP2-ZELLEN
4.1.5. IMMUNFLUORESZENZ AUF PRIMATENGEWEBE
4.1.6. IMMUNFLUORESZENZ AUFCRITHIDIA LUCILIAE
4.1.7. HAEMAGGLUTINATIONSTEST
4.1.8. EARR- UNDPEG-ASSAY
4.1.9. LATEX-FIXATIONS- UND WAALER-ROSE-TEST
4.2. NACHWEIS VON ANTIKOERPERN GEGEN GRANULOZVTAERE ANTIGENE 21
4.2.1. NACHWEIS VON ANCA MITTELS
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
4.2.2. MYELOPEROXIDASEL C-ANCA (ALPHA-FRAKTION) ELISA
4.2.3. CATHEPSIN G/ELASTASE-ELISA
4.3. ETABLIERUNG EINES ANTI-PROTEINASE-3-SPEZIFISCHEN B-ZELL
KLONS
23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.4. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ANTIKOERPERN
23
4.4.1. PROTEIN G SEPHAROSE CHROMATOGRAPHIE (IGG-REINIGUNG)
4.4.2. DEAE SEPHAROSE CHROMATOGRAPHIE
4.4.3. ISOLIERUNG VON MONOSPEZIFISCHEN ANTI-POTEINASE-3-
ANTIKOERPEM
4.4.4. PRAEPARATION VON F(AB')^-FRAGMENTEN
4.4.5. PROTEINEINENGUNG
4.4.6. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION
4.5. REINIGUNG VON ANTIGENEN MITTETE SAEULENCHROMATOGRAPHIE 25
4.5.1. IMMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
4.5.2. REINIGUNG VON PR-3
4.6. GEL-ELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT 26
4.6.1. SDS-POLYACRYLAMIDGEL ELEKTROPHORESE
4.6.2. SILBER-FAERBUNG
4.6.3. COOMASSIE-FAERBUNG
4.6.4. WESTERN BLOT ~~
4.6.5. ANTIKOERPERELUTION VON DER NITROZELLULOSE
4.7. PRAEPARATION VON ZELLEXTRAKTEN 28
4.7.1. ALPHA-FRAKTION AUS HUMANEN GRANULOZYTEN
4.7.2. "ACID"-EXTRAKT AUS NEUTROPHILEN
4.7.3. HEP2-ZELLEXTRAKT
4.7.4. MEMBRANEXTRAKTE VON NABELSCHNURENDOTHELZELLEN
4.7.5. BIOTINYLIERUNG VON ENDOTHELIALEN OBERFLAECHENPROTEINEN
4.8. MIKROSKOPISCHE METHODEN
30
4.8.1. IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE MIT KULTURZELLEN
4.8.2. IMMUNFLUORESZENZ AUF NABELSCHNURSCHNITTEN
4.8.3. NACHWEIS VON OBERFLAECHENANTIGENEN AUF
NABELSCHNURENDOTHELZELLEN MITTELS
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
4.8.4. IMMUNOGOLDFAERBUNG
4.8.5. LASER-SCAN MIKROSKOPIE
4.8.6. ELEKTRONENMIKROSKOPIE
4.9. ISOLATION UND KULTUR VON HUMANEN
NABELSCHNURENDOTHELZELLEN 33
4.10. ZVTO-HLTSAS MIT NABELSCHNURENDOTHELZELLEN
34
4.10.1. ZYTO-ELISA MIT NABELSCHNURENDOTHELZELLEN (SEREN)
4.10.2. ZYTO-ELISA MIT NABELSCHNURENDOTHELZELLEN (KINETIK)
4.11. ZVTOTOXIZITAETS-ASSAVS MIT NABELSCHNURENDOTHELZELLEN 38
4.11.1. ZYTOTOXMTAETS-ASSAYS OHNE NEUTROPHILE
4.11.2. ZYTOTOXMTAETS ASSAY MIT NEUTROPHILEN
4.11.3. THYMIDINEINBAU-KINETIK
SEITE 3
4.12. UNTERSUCHUNGEN ZUR ANTIKOERPERBINDUNG AN
NABELSCHNURENDOTHELZELLEN 40
4.12.1. INHIBITIONSVERSUCHE
4.12.2 KONTROLLEN DER SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERBINDUNG
4.12.3. DEPLETION VON IMMUNKOMPLEXEN
4.12.4. DOPPELSSRBUNG MIT ANTIKOERPERN GEGEN ENDOPLASMATISCHES
RETIKULUM
4.12.5. BLOCKIERUNG DER ZYTOKINWIRKUNG MIT ANTIKOERPERN GEGEN
TNF-ALPHA
4.13. UNTERSUCHUNG VON ANTIKOERPEREFFEKTEN AUF
NABELSCHNURENDOTHELZELLEN 4I
4.13.1. BESTIMMUNG DER PROKOAGULATORISCHEN AKTIVITAET DURCH
MESSUNG DER REKALZIFIZIERUNGSZEIT
4.13.2. MESSUNG DER NEUTROPHILENADHAESION AN
NABELSCHNURENDOTHELZELLEN
4.13.3. FLOW-ZYTOMETRISCHE ANALYSEN
_
4.14. LISTE DER VERWENDETEN CHEMIKALIEN 43
5. ERGEBNISSE
46
5.1. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ANTI-PROTEINASE-3-
ANTIKOERPEM 46
5.2. NACHWEIS VON PROTEINASE 3 IN HUMANEN ENDOTHELZELLEN
50
5.3. TRANSLOKATION DER PROTEINASE 3 IM ZYTOPLASMA VON
NABELSCHNURENDOTHELZELLEN NACH ZVTOKINBEHANDLUNG 56
5.4. NACHWEIS DER PROTEINASE 3 IN DER PLASMAMEMBRAN VON NEZ
IM ZVTO-ELISA MIT UNFIXIERTEN NABELSCHNURENDOTHELZELLEN 66
5.5. EFFEKTE DER ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER AUF HUMANE
ENDOTHELZELLEN 81
5.5.1. ZYTOTOXISCHE EFFEKTE DER ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER
5.5.2. STEIGERUNG DER ENDOTHELIALEN PROKOAGULATORISCHEN
AKTIVITAET DURCH ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER
5.5.3. STEIGERUNG DER EXPRESSION VON ENDOTHELIALEN
ADHAESIONSMOLEKUELEN DURCH ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER
5.5.4. STEIGERUNG DER ENDOTHELIALEN NEUTROPHILENADHAESION DURCH
ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER
6, DISKUSSION 95
6.1. HUMANE ENDOTHELZELLEN ALS ZIELSTRUKTUR FUER ANTIKOERPER
95
6.2. NACHWEIS VON PROTEINASE 3 IN HUMANEN ENDOTHELZELLEN 101
6.3. STEIGERUNG DER ENDOTHELIALEN NEUTROPHILENADHAESION DURCH
ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER 106
6.4. STEIGERUNG DER ENDOTHELIALEN PROKOAGULATORISCHEN AKTIVITAET
DURCH ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER 109
SEITE 4
6.5. ZVTOPLASM
ATISCHE TRANSLOKATION UND MEMBRANEXPRESSION
DER PROTEINASE-3 IN HUMANEN ENDOTHELZELLEN UEQ
6.
6
. ZYTOTOXISCHE EFFEKTE DER ANTI-PROTEMASE-3-ANTIKOERPER AUF
HUMANE ENDOTHELZELLEN
112
6.7.
MODIFIZIERTES KONZEPT PATHOGENETISCHER
WIRKUNGEN
DER
ANTI-PROTEINASE-3-ANTIKOERPER IM RAHMEN ANCA-ASSOZIIERTER
VASKULITIDEN
118
7. ZUSAMMENFASSUNG
122
8. LITERATURVERZEICHNIS
124
A
NHANG 153
9.1. ABBILDUNGEN UND TABELLEN
153
9.2. LISTE DER ABKUERZUNGEN
137
9.3. MESSWERTE
189
SEITE 5 |
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