Molekulare Untersuchungen an der Gibberellin A 20 -3beta-Hydroxylase aus Hordeum vulgare und Arabidopsis thaliana:
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| Sprache: | German |
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1996
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| Beschreibung: | Bochum, Univ., Diss., 1997 |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
LISTE
DER
VERWENDETEN
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
9
2.2
FEIN
UND
RADIOCHEMIKALIEN
12
2.3
PFLANZENMATERIAL,
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
14
2.4
ANZUCHT
UND
ERNTE
DER
PFLANZEN
15
2.5
NACHWEIS
DES
GIBBERELLINS
A|
15
2.5.1
ENZYMPRAEPARATION
AUS
GEKEIMTEN
GERSTENKARYOPSEN
15
2.5.2
GEWINNUNG
VON
BAKTERIELLEM
PROTEINROHEXTRAKT
17
2.5.3
GIBBERELLIN
AIO-UMSETZUNG
IM
ZELLFREIEN
SYSTEM
UND
EXTRAKTION
DES
REAKTIONSPRODUKTES
GIBBERELLIN
AI
(GAI)
17
2.5.4
NACHWEIS
DES
REAKTIONSPRODUKTES
GAI
DURCH
EINEN
RADIOIMMUNOASSAY
(RIA)
18
2.5.5
ABHAENGIGKEIT
DER
ENZYMAKTIVITAET
VON
DEM
INHIBITOR
CGA
179.500
SOWIE
DESSEN
DERIVATE
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
19
2.5.6
ABHAENGIGKEIT
DER
ENZYMAKTIVITAET
VON
VERSCHIEDENEN
SALZEN
20
2.6
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
TRENNVERFAHREN
VON
PROTEINEN
20
2.6.1
GELFILTRATION
20
2.6.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
21
2.6.3
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
21
2.6.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
23
2.7
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
26
2.7.1
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
26
2.7.2
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
27
2.7.3
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
27
2.8
ERSTELLEN
EINER
X-ZAP
CDNA-BANK
AUS
HORDEUM
VULGARE
28
2.9
IDENTIFIKATION
UND
SYNTHESE
DEGENERIERTER
UND
SPEZIFISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
GEGEN
HOMOLOGE
BEREICHE
BEKANNTER
DIOXYGENASESEQUENZEN
28
2.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
31
2.11
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
ZUR
ELEKTROTRANSFORMATION
32
2.12
KLONIERUNG
VON
DNA
IN
VERSCHIEDENE
VEKTORSYSTEME
33
2.13
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
33
2.14
HERSTELLUNG
VON
VERKUERZUNGSKLONEN
MITTELS
EXONUKLEASE-ABBAU
34
2.15
RNA
UND
MRNA-ISOLIERUNG
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
36
2.16
CDNA-SYNTHESE
VON
RNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
36
2.17
PRAEPARATION
EINER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA
37
2.18
ANALYSE
DER
X-ZAP
CDNA-BANK
MIT
EINER
32
P-MARKIERTEN
DNA
UND
EINEM
POLYKLONALEN
ANTIKOERPER
38
2.19
IN
VIVO-EXCISION
VON
PHAGEN-DNA
39
2.20
TRANSFER
VON
RNA
UND
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
40
2.21
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
41
2.22
PRAEPARATION
VON
EINSCHLUSSKOERPEM
42
2.23
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
ISOLIERTEM
PROTEIN
43
2.24
REINIGUNG
DES
ANTISERUMS
44
2.25
ELEKTROPHORETISCHER
PROTEINTRANSFER
AUF
EINE
NITROCELLULOSE-MEMBRAN
45
2.26
IMMUNODETEKTION
45
2.27
AUSWERTUNG
46
3.
ERGEBNISSE
47
3.1
WACHSTUMSKINETIK
VON
HORDEUM
VULGARE
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DEM
INHIBITOR
CGA
179.500,
DESSEN
DERIVATEN
UND
VON
QUADRATSAEUREN
47
3.2
3SS-HYDROXYLASE-AKTIVITAET
IN
KEIMLINGEN
VON
HORDEUM
VULGARE
NACH
DUNKELINKUBATION
49
3.3
ABHAENGIGKEIT
DER
3SS-HYDROXYLASE-AKTIVITAET
VON
DEN
KONZENTRATIONEN
DER
INHIBITOREN,
DEREN
DERIVATEN
UND
VON
QUADRATSAEUREN
51
3.4
LOKALISATION
DER
3SS-HYDROXYLAESE-AKTIVITAET
IM
GERSTENKEIMLING
52
3.5
ABHAENGIGKEIT
DER
ENZYMAKTIVITAET
DER
3SS-HYDROXYLASE
VON
VERSCHIEDENEN
SALZEN
53
3.5.1
ERMITTLUNG
DES
K
M
-
UND
V
M
-WERTES
56
3.5.2
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
DES
ENZYM-INHIBITOR
KOMPLEXES
58
3.6
REINIGUNG
DER
3SS-HYDROXYLASE
59
3.6.1
GELFILTRATION
59
3.6.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
61
3.6.3
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
62
3.6.3.1
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MIT
STUFEN
UND
LINEARER
GRADIENTENELUTION
62
3.6.3.2
BESTIMMUNG
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
DURCH
VERSCHIEDENE
PH-WERTE
64
3.6.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
NACH
SYNTHESE
UNTERSCHIEDLICHER
SAEULENMATRIZES
66
3.6.5
KOMBINATION
DER
EINZELNEN
SAEULENCHROMATOGRAPHIEVERFAHREN
67
3.6.6
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
68
3.6.7
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
VON
ELUTIONSFRAKTIONEN
AUS
DER
HYDROPHOBEN
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
UND
DER
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
71
3.7
KLONIERUNG
DER
DNA-SEQUENZ
DER
3SS-HYDROXYLASE
73
3.7.1
HERSTELLUNG
EINER
X-ZAP
CDNA
BANK
AUS
HORDEUM
VULGARE
73
3.7.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
73
3.7.2.1
SYNTHESE
DEGENERIERTER
OLIGONUKLEOTIDE
GEGEN
73
HOMOLOGE
BEREICHE
BEKANNTER
DIOXYGENASEN
3.7.2.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION,
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
DNA
75
3.7.3
POLYMERASE-KETTENREAKTION
MIT
SPEZIFISCHEN
OLIGOMIKLEOTIDEN
76
3.7.3.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
MIT
CDNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
77
3.7.3.2
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
FRAGMENTES
78
3.7.3.3
UMKLONIERUNG
DES
DNA-FRAGMENTES
IN
DEN
UEBEREXPRESSIONSVEKTOR
PEXP
2
79
3.7.4
ANALYSE
DER
X-ZAP
CDNA
BANK
MIT
32
P-MARKIERTEM
FRAGMENT
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
82
3.7.4.1
IN
VZVO-EXCISION
UND
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
POSITIVER
PHAGEN
83
3.7.4.2
DNA-DNA-HYBRIDISIERUNG
DER
RESTRINGIERTEN
PLASMIDE
84
3.7.5
DNA-RNA-HYBRIDISIERUNG
DER
RNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
UND
HORDEUM
VULGARE
85
3.7.6
HYBRIDISIERUNG
DER
32
P-MARKIERTEN
SONDE
MIT
GENOMISCHER
DNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
88
3.8
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
3SS-HYDROXYLASE
90
3.8.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
90
3.8.2
IMMUNODETEKTION
DER
3SS-HYDROXYLASE
IN
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
UND
HORDEUM
VULGARE
92
3.8.3
ANALYSE
DER
CDNA-BANK
AUS
HORDEUM
VULGARE
MIT
DEM
GEREINIGTEN
ANTIKOERPER
96
3.9
ERMITTLUNG
DER
KOMPLETTEN
CDNA-SEQUENZ
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
97
4.
DISKUSSION
99
5.
ZUSAMMENFASSUNG
HO
6.
LITERATURVERZEICHNIS
112
ANHANG |
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