Die NADPH:Cytochrom-P450-Reduktase des Schlafmohns, Papaver somniferum: Reinigung, Immunisierung, cDNA-Isolierung und heterologe Expression
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| adam_text | DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND
PHARMAZIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
DIENADPH:CYTOCHROM-P450-REDUKTASE DES SCHLAFMOHNS, PAPAVER SOMNIFERUM:
REINIGUNG, IMMUNISIERUNG, . CDNA-ISOLIERUNG UND HETEROLOGE EXPRESSION
VORGELEGT VON ANGELA ROSCO AUS MUENCHEN 1997 INHALTSVERZEICHNIS I.
EINLEITUNG 1 II. MATERIAL 26 II. 1. BIOLOGISCHES MATERIAL..... 26 II.
1.1. PFLANZLICHES MATERIAL 26 II. 1.2. BAKTERIENSTAEMME , 27 II.1.3.
HEFEN 27 II. 1.4. INSEKTENZELLEN 28 II. 1.5. VERSUCHSTIERE 28 II.2.
CHEMIKALIEN UND RADIOISOTOPE 29 UE.3. KULTURMEDIEN ! 31 UE.4. VEKTOREN UND
OLIGONUKLEOTIDE 33 11.5. ENZYME UND *ENZYMKITS 36 11.6. GERAETE ,36 HI.
METHODEN 39 III. 1. HERSTELLUNG ZELLFREIER ENZYMEXTRAKTE 39 III. 1.1.
MIKROSOMENPRAEPARATIONEN AUS PFLANZLICHEN ZELLSUSPENSIONS- KULTUREN 39
ULI.2. MIKROSOMENPRAEPARATIONEN AUS DIFFERENZIERTEN PFLANZEN 40 HI. 1.3.
MIKROSOMENPRAEPARATIONEN AUS HEFE 41 HI. 1.4. MIKROSOMENPRAEPARATIONEN AUS
INSEKTENZELLEN 42 III. 1.5. AUFSCHLUSS PFLANZLICHER
ZEILSUSPENSIONSKULTUREN ZUR GEWIN- NUNG LOESLICHER ENZYME 42 I III.2.
CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN 43 111.2.1. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 44
111.2.2. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 45 111.2.3.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE ZUR ALKALOIDANALYSE 47 III. 3.
ENZYMTESTVERFAHREN 47 111.3.1. GLUCOSE-6-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE 47
111.3.2. NADPH:CYTOCHROM-P450-REDUKTASE 48 111.3.3. SALUTARIDIN-SYNTHASE
49 111.3.4. BERBERINBRUECKENENZYM(RETIKULINOXIDASE) 50 111.3.5.
SALUTARIDINOL-7-O-ACETYLTRANSFERASE :.51 111.4. GELELEKTROPHORESE VON
PROTEINEN 52 III.4.1.NATIVEPOLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 52 111.4.2.
DENATURIERENDE SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 54 111.4.3. FAERBEN VON
PROTEINGELEN 56 111.5. PROTEINGEHALTSBESTIMMUNGEN 59 111.6. ENZYMATISCHE
SYNTHESE VON (R)-[N- 14 CH 3 ]RETIKULIN 60 HI.7.
RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNGEN 62 111.8. IMMUNOLOGISCHE VERFAHREN 63
111.8.1. IMMUNISIERUNG VON HUEHNERN 64 111.8.2. REINIGUNG POLYKLONALER
ANTIKOERPER AUS DEM HUEHNEREI 65 111.8.3. IMMUNOBLOTTING (*WESTERNBLOT )
67 111.8.4. IMMUNOTITRATION 70 111.9. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 72
111.9.1. PRAEPARATION VON GESAMT-RNA AUS PFLANZLICHEN ZELL-
SUSPENSIONSKULTUREN 72 111.9.2. PRAEPARATION VON MRNA UND DENATURIERUNG
74 N 111.9.3. PRAEPARATION VON GENOMISCHER DNA AUS PFLANZLICHEN ZELL-
SUSPENSIONSKULTUREN 75 111.9.4. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN
76 III. 10. ENZYMATISCHE MODIFIKATIONEN VON NUKLEINSAEUREN 78 III. 10.1.
RESTRIKTIONSANALYSEN 78 III. 10.2. LIGATIONSREAKTIONEN 79 III. 10.3.
PHOSPHORYLIERUNG VON DNA, RADIOAKTIVE ENDMARKIERUNG 79 III. 10.4.
RADIOAKTIVE MARKIERUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA 80 III. 11. TRANSFORMATION
VON E. COLI 81 III. 12. POLYMERASEKETTENREAKTION 82 III. 13.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 85 III. 13.1. ELEKTROPHORESE
VON DNA ... 85 III. 13.2. ELEKTROPHORESE VON RNA . 85 III. 14.
ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS DEM AGAROSEGEL 87 III. 15.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND RNA :....88 III. 16. SEQUENZIERUNG
VON DNA 89 III. 17. ANLEGEN UND DURCHMUSTERN EINER CDNA-BIBLIOTHEK 92
III. 17.1. CDNA-SYNTHESE UND KLONIERUNG IN DEN UNI-ZAP*XR- PHAGENVEKTOR
92 III. 17.2. IN V/ /RO-VERPACKUNG VON A.-PHAGEN UND INFEKTION VON
BAKTERIEN 94 III. 17.3. BESTIMMUNG DES PHAGENTITERS 95 IN.17.4.
DURCHMUSTERN DER CDNA-BIBLIOTHEK IN A.-PHAGEN 95 III. 17.5. IN
V/VO-EXCISION EINES ISOLIERTEN KLONS UND IDENTIFIZIERUNG ...96 III
111.18. NUKLEINSAEURE-*BLOTS 97 III. 18.1. TRANSFER VON DNA AUF
NYLONMEMBRAN, *SOUTHERN BLOTTING 98 III. 18.2. TRANSFER VON RNA AUF
NYLONMEMBRAN, *NORTHERN BLOTTING 99 III.18.3. HYBRIDISIERUNG MIT
CDNA-PROBEN 100 III. 18.4. ENTFERNUNG VON HYBRIDISIERTEN PROBEN 102 III.
19. TRANSFORMATION VON HEFE 102 111.20. PROTEINEXPRESSION IN
INSEKTENZELLEN 104 IN.20.1. HERSTELLUNG REKOMBINANTER BACMID-DNA 105
111.20.2. TRANSFEKTION VON INSEKTENZELLEN 106 111.20.3. GEWINNUNG VON
VIRUSSTOCKLOESUNG UND INFEKTION VON INSEKTENZELLEN 107 IV. ERGEBNISSE 108
IV. 1. UNTERSUCHUNGEN ZUR CHARAKTERISIERUNG EINER PAPAVER
*SOMH^RW/N-ZELLSUSPENSIONSKULTUR 108 IV.2. REINIGUNG DER
NADPH:CYTOCHROM-P450-REDUKTASE AUS PAPAVER
.YO/N//ERW/W-ZELLSUSPENSIONSKULTUREN 113 IV.2.1. MIKROSOMENPRAEPARATION
114 IV.2.2. SOLUBILISIERUNG MIT CHAPS UND EMUIGEN 911 114 IV.2.3.
IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AN DEAE-ZELLULOSE 116 IV.2.4.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN 2 ,5 ADP-SEPHAROSE 4B 117 IV.2.5.
ZUSAMMENFASSENDE UEBERSICHT DER REINIGUNG SOWIE DARSTEL- LUNG DER
HOMOGENITAET DES ENZYMS : 118 IV.2.6.
NATIVEPOLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 120 IV IV.3. CHARAKTERISIERUNG DER
PAPAVER SOMNIFERUM-NADPH.CYTO- CHROM-P450-REDUKTASE 122 IV.3.1.
PH-OPTIMUM 122 IV.3.2. SUBSTRAT-AFFINITAET 124 IV.3.3.
COFAKTORABHAENGIGKEIT 127 IV.3.4. MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG 128 IV.3.5.
VERTEILUNG DERNADPH:CYTOCHROM-P450-REDUKTASE- AKTIVITAET IN VERSCHIEDENEN
PFLANZENTEILEN VON PAPAVER SOMNIFERUM 130 IV.4. IDENTIFIZIERUNG DES
GEGEN DIE NADPH:CYTOCHROM-P450- REDUKTASE GERICHTETEN POLYKLONALEN
ANTIKOERPERS 131 IV.4.1. NACHWEIS DES AVIAEREN ANTIKOERPERS 132 IV.4.2.
HEMMUNG DER ENZYMAKTIVITAET DURCH DIE ANTIKOERPER 134 IV.5.
AMINOSAEURESEQUENZBESTIMMUENG DER NADPH:CYTOCHROM- P450-REDUKTASE . 136
IV.5.1. ERZEUGUNG INTERNER PEPTIDE 136 IV.5.2. AUTOMATISCHE
SEQUENZIERUNG 137 IV.5.3. DATENBANKVERGLEICH 138 IV.6. ISOLIERUNG UND
SEQUENZIERUNG DER NADPH:CYTOCHROM-P450- REDUKTASE-CDNA AUS PAPAVER
SOMNIFERUM 139 IV.6.1. AUFBAU EINER CDNA-BIBLIOTHEK VON PAPAVER
SOMNIFERUM 139 IV.6.2. ERMITTLUNG EINER GEEIGNETEN OLIGONUKLEOTIDSONDE,
*NORTHERNBLOT -ANALYSE UND SEQUENZIERUNG DER SONDE 140 IV.6.3.
DURCHMUSTERN DER CDNA-BIBLIOTHEK UND ISOLIERUNG VON CDNA-KLONEN 150
IV.6.4. SUBKLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES NADPH:CYTO-
CHROM-P450-REDUKTASE-VOLLAENGEKLONS 153 F/.6.5. DATENBANKVERGLEICH *. 158
IV.6.6. *SOUTHERNBLOF -ANALYSE MIT GENOMISCHER DNA VON PAPAVER
SOMNIFERUM 162 IV.6.6.1. AMPLIFIZIERUNG DES LESERAHMENS DER NADPH:CYTO-
CHROM-P450-REDUKTASE-CDNA 162 IV.6.6.2. HYBRIDISIERUNG VON GENOMISCHER
DNA 165 IV. 7. HETEROLOGE EXPRESSION DER PAPAVER SOMNIFERUM-NADPU.CYTO-
CHROM-P450-REDUKTASE : 167 IV.7.1. EXPRESSION IN HEFE 167 IV.7.1.1.
KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN 167 IV. 7.1.2. UNTERSUCHUNG DER
TRANSFORMIERTEN HEFE AUF ENZYM- AKTIVITAET 171 IV.7.2. EXPRESSION IN
INSEKTENZELLEN 174 IV.7.2.1. KONSTRUKTION EINES REKOMBINANTEN
DONORPLASMIDS 174 IV. 7.2.2. UNTERSUCHUNG INFIZIERTER INSEKTENZELLEN AUF
ENZYM- AKTIVITAET 176 V.DISKUSSION 178 VI. ZUSAMMENFASSUNG 198 VN.
LITERATURVERZEICHNIS 201 VI
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| title_short | Die NADPH:Cytochrom-P450-Reduktase des Schlafmohns, Papaver somniferum |
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| title_sub | Reinigung, Immunisierung, cDNA-Isolierung und heterologe Expression |
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