Untersuchungen zur Signaltransduktion des Interleukin-1-Rezeptors Typ I:
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1997
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V
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 FUNKTION DES IMMUNSYSTEMS.,.1
1.2 ZELLEN DES IMMUNSYSTEMS.2
1.2.1 ZELLEN DES NATUERLICHEN IMMUNSYSTEMS. 2
1.2.2 LYMPHOZYTEN.2
1.2.2.1 B-LYMPHOZYTEN
.3
1.2.2.2 T-LYMPHOZYTEN
.4
1.3 ZYTOKINE. 6
1.3.1 DAS LNTERLEUKIN-1-SYSTEM.7
1.3.2 DAS IL-1-REZEPTOR-SYSTEM.10
1.3.3 VORGAENGE BEI DER SIGNALTRANSDUKTION DURCH DEN
LNTERLEUKIN-1-REZEPTOR.13
1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.15
2 MATERIAL.17
2.1 GERATE.17
2.2 CHEMIKALIEN.18
2.3 MATERIAL FUER ZELLKULTUR UND ELISA.19
2.4 ENZYME UND MOLEKULARBIOLOGISCHE KITS.19
2.5 ANTIKOERPER UND ELISAS.20
2.5.1 POLYKLONALE ANTIKOERPER.20
2.5.2 MONOKLONALE ANTIKOERPER.20
2.5.3 ELISAS.21
2.6 ZELLKULTURMEDIEN UND ZUSAETZE, ANTIBIOTIKA, ZYTOKINE.21
2.6.1 MEDIUM UND ZUSAETZE.21
2.6.2 ANTIBIOTIKA.21
2.6.3 ZYTOKINE.21
2.6.4 MITOGENE.21
2.7 ZELLINIEN.22
2.8 MEDIEN FUER BAKTERIENKULTIVIERUNG.22
2.9 BAKTERIENSTAEMME.
22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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VI
2.10 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD.23
2.11 PLASMIDE.23
2.12 OLIGONUKLEOTIDE.24
2.12.1 DELETIONSPRIMER.24
2.12.2 MUTAGENESE-PRIMER.25
2.12.3 SEQUENZIER-PRIMER.'.26
2.12.4 OLIGONUKLEOTIDE FUER EMSA.26
2.13 HAEUFIG VERWENDETE PUFFER UND LOESUNGEN.27
3 METHODEN.29
3.1 BAKTERIENKULTIVIERUNG.29
3.1.1 ANZUCHTBEDINUNGEN FUER BAKTERIEN.29
3.1.2 MESSUNG DER BAKTERIENDICHTE.29
3.1.3 PRAEPARATION KOMPETENTER E. CO//-BAKTERIEN.29
3.2 DNA/RNA-TECHNIKEN.30
3.2.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.30
3.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS E.
COLI IN ANALYTISCHEM MASSSTAB. .31
3.2.2.1 PLASMID-MINI-PRAEPARATION DURCH ALKALISCHE LYSE
.31
3.2.2.2 PLASMID-PRAEPARATION MIT BIORAD QUANTUM PREP
YY
SYSTEM.31
3.2.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IN PRAEPARATIVEN MASSSTAB.32
3.2.4 SCHNEIDEN DER DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.32
3.2.5 AUFTRENNUNG VON DNA DURCH HORIZONTALE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.32
3.2.6 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN MITTELS QIAEX
AGAROSE GEL EXTRACTION KIT II.32
3.2.7 DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMIDEN UND LIGATION MIT
DNA-FRAGMENTEN.33
3.2.8 TRANSFORMATION VON E. CO//-STAEMMEN.33
3.2.9 SELEKTION UND DIFFERENZIERUNG TRANSFORMIERTER E.
COLI -BAKTERIEN.34
3.2.10 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).34
3.2.11 SEQUENZ-SPEZIFISCHE MUTAGENESE VON DNA.35
3.2.12 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA.36
3.2.12.1 S'-ENDMARKIERUNG MIT POLYNUKLEOTIDKINASE
.36
3.2.12.2 ABTRENNUNG VON NICHT EINGEBAUTEN RADIOAKTIVEN NUKLEOTIDEN
.36
3.2.12.3 RANDOM PRIMER MARKIERUNG VON DNA-SONDEN
.37
3.3 PRAEPARATION UND ANALYSE VON RNA.37
3.3.1 RNA PRAEPARATION MIT NONIDET P-40-METHODE.37
3.3.2 AUFTRENNUNG DER RNA IN 1% AGAROSE-GEL.38
3.3.3 A/ORFBEM-SS/OF-RNA-TRANSFER.39
VII
3.3.4 HYBRIDISIERUNG DER IMMOBILISIERTEN RNA.40
3.3.5 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON RNA-SONDEN.42
3.3.6 RNASE PROTECTION ASSAY
.43
3.4 ZELLKULTURARBEITEN.44
3.4.1 ZELLKUKTURMEDIEN.44
3.4.2 KULTIVIEREN VON ZELLEN.,.44
3.4.3 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN.44
3.4.4 ZELLZAHL- UND VITALITAETSBESTIMMUNG.45
3.5 ZYTOKIN-NACHWEIS IN ZELLYSATEN UND KULTURQBERSTAENDEN.45
3.5.1 PROLIFERATIONSTEST ZUR IL-1 -BESTIMMUNG.45
3.5.2 BERECHNUNG DER ZYTOKIN-KONZENTRATIONEN IN PROLIFERATIONSTESTS.46
3.5.3 BESTIMMUNG VON ZYTOKIN-KONZENTRATIONEN MITTELS ELISA-TECHNIK.46
3.6 AKTIVITATSBESTIMMUNG DER NEUTRALEN UND SAUREN SPHINGOMYELINASE.47
3.6.1 PROTEINBESTIMMUNG MIT BICINCHONINSAEURE.47
3.6.2 VORBEREITUNG VON [N-METHYL
14C]-SPHINGOMYELIN.47
3.6.3 MESSUNG DER SAUREN SPHINGOMYELINASE.48
3.6.4 MESSUNG DER NEUTRALEN SPHINGOMYELINASE. 49
3.7 TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN.50
3.7.1 TRANSFEKTION MIT DOTAP-TRANSFEKTIONS-REAGENZ.50
3.7.2 TRANSFEKTION MIT DEAE-DEXTRAN.51
3.
7.2.1 VORBEREITUNG DER ZELLEN.51
3.7.2.2 EINFUEHREN DER DNA IN DIE ZELLEN
.51
3.7.3 SELEKTION STABILER TRANSFEKTANTEN.52
3.7.4 MESSUNG DER IL-2-PROMOTOR-AKTIVITAET MIT HILFE VON REKOMBINANTEN
IL-2-PROMOTOR-
LUCIFERASE-KONSTRUKTEN.52
3.7.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION DER ZELLEN MIT DEM
IL-2-PROMOTOR-KONSTRUKT.53
3.7.6 STIMULIERUNG DER TRANSFIZIERTEN ZELLEN.53
3.7.7 BESTIMMUNG DER LUCIFERASE-AKTIVITAET.53
3.8 IL-1-REZEPTOR-ANALYSEN.54
3.8.1 INTERNALISIERUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEN ZYTOKINEN.54
3.8.2 BINDUNG VON [
125L]-IL-1A AN ZELLOBERFLAECHEN-REZEPTOREN.54
3.8.3 DETEKTION VON IL-1 RI AUF DER ZELLOBERFLAECHE.55
3.9 PRAEPARATION VON KEMEXTRAKTEN AUS KULTURZELLEN.56
3.9.1 KEMEXTRAKTION I .56
3.9.2 KEMEXTRAKTION II .57
VIII
3.10 ANALYSE DNA-BINDENDER PROTEINE.58
3.10.1
ANNEALING VON SYNTHETISCH HERGESTELLTEN EINZELSTRAENGIGEN OLIGOMEREN.58
3.10.2 NACHWEIS DNA-BINDENDER PROTEINE DURCH
ELECTROPHORETIC MOBILITY
SHIFTASSAYS (EMSA)
.58
3.10.3 NACHWEIS DER SPEZIFITAET DES DNA-PROTEIN-KOMPLEXES.59
3.10.4 ANALYSE DER DNA-PROTEIN KOMPLEXE.59
4 ERGEBNISSE.60
4.1 CHARAKTERISIERUNG DES EXPERIMENTELLEN SYSTEMS.60
4.1.1 KOSTIMULIERUNG VON EL4D6/76-ZELLEN ZU IL-2-SEKRETION DURCH TNF,
ABER NICHT DURCH IL-1.61
4.1.2 FAEHIGKEIT VON EL4D6/76-ZELLEN ZUR INTERNALISIERUNG VON TNF, ABER
NICHT VON IL-1.63
4.1.3 NFTCB-AKTIVIERUNG DURCH TNF IM IL-1-INSENSJTIVEN SUBKLON
EL4D6/76.63
4.2 CHARAKTERISIERUNG VON IL-1 NF.66
4.2.1 KINETIK DER IL-1 NF-AKTIVIERUNG.66
4.2.2 EFFEKT VON ACTINOMYCIN D ODER CYCLOHEXIMID AUF DIE IL-1
NF-AKTIVIERUNG.68
4.2.3 HEMMUNG DER AKTIVIERUNG VON IL-1 NF DURCH DICHLORISOCOUMARIN UND
PYRROLIDINDITHIOCARBAMAT. 69
4.2.4 BETEILIGUNG DER P65-NFICB-UNTEREINHEIT AM IL-1NF-KOMPLEX.70
4.3 HINWEISE AUF EINEN INTRAZELLULAEREN AKTIVIERUNGSMECHANISMUS IM
IL-1-SYSTEM.72
4.3.1 TRANSFEKTION VON EL4 5D3- UND EL4D6/76-ZELLEN MIT FLAG-HLL-1A.72
4.3.2 EFFEKT VON INTRAZELLULAEREM IL-1A AUF DIE IL-2-PRODUKTION.74
4.3.3 EINFLUSS VON INTRAZELLULAEREM FLAG-HLL-1A AUF
IL-2-MRNA-PRODUKTION.76
4.3.4 AUSWIRKUNG DER INTRAZELLULAEREN FLAG-HLL-1A-EXPRESSION AUF DIE
AKTIVIERUNG
DES NUKLEAEREN FAKTOR IL-1 NF.79
4.3.5 AUSWIRKUNGEN VON INTRAZELLULAEREM IL-1 AUF INTERNALISIERUNG UND
AUFTRETEN
VON IL-1 RI AN DER ZELLOBERFLAECHE.80
4.4 FOLGEN DER INTERNALISIERUNG DES AKTIVIERTEN
IL-1-REZEPTOR-KOMPLEXES.85
4.4.1 FUNKTIONELLE KOPPLUNG VON INTERNALISIERUNG DES IL-1/IL-1
RL-KOMPLEXES
UND AKTIVIERUNG DER A-SMASE.85
4.4.2 REKONSTITUTION DER IL-1-INDUZIERTEN IL-2-SEKRETION IN EL4D6/76
DURCH
TRANSFEKTION MIT IL-1RACP-CDNA.87
4.4.3 REKONSTITUTION DER A-SMASE-AKTIVIERUNG IN EL4D6/76 DURCH
TRANSFEKTION MIT IL-1RACP.88
4.4.4 REKONSTITUTION DER NFTCB-AKTIVIERUNG IN EL4D6/76 DURCH
TRANSFEKTION MIT IL-1 RACP.
90
IX
4.5 STRUKTUR-FUNKTIONS-ANALYSEN VON IL-1RAEP.93
4.5.1 ETABLIERUNG EINES TESTSYSTEMS ZUR FUNKTIONELLEN ANALYSE VON
IL-1RACP-KONSTRUKTEN IN TRANSIENTEN TRANSFEKTIONEN.93
4.5.2 VERKUERZUNG DER ZYTOPLASMATISCHEN DOMAENE VON IL-1RACP.95
4.5.3 TRANSFEKTION VON EL4D6/76-ZELLEN MIT VERKUERZTEN FORMEN VON IL-1
RACP.98
4.5.4 EINFUEHRUNG VON MUTATIONEN IN DER ZYTOPLASMATISCHEN DOMAENE VON
IL-IRACP.99
5 DISKUSSION.103
5.1 CHARAKTERISIERUNG DES IL-1-INDUZIERBAREN NUKLEAEREN FAKTORS
IL-1NF.103
5.2 ABHAENGIGKEIT DER A-SMASE-AKTIVITAET VON IL-1RACP.105
5.3 ABLAUFEINES INTRAZELLULAEREN AKTIVIERUNGSMECHANISMUS IN
EL4-ZELLEN.108
5.4
STRUKTUR-FUNKTIONS-ANALYSEN VON IL-1RACP
.~R.
114
5.5 AUSBLICK.117
6 ZUSAMMENFASSUNG.119
7 LITERATUR.-.122
8 PUBLIKATIONEN
137 |
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