Autoantikörper bei kardiovaskulären Erkrankungen: Identifizierung und Charakterisierung von Antikörpern gegen Calpastatin und Analyse der klinischen Bedeutung
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| Sprache: | German |
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1996
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 AUTOIMMUNITAET.1
1.1.1 WITEBSKYS POSTULATE.4
1.1.2 TOLERANZMECHANISMEN.6
1.1.3 MECHANISMEN DER AUTOIMMUNITAET.7
1.2 AUTOANTIKOERPER UND KARDIOVASKULAERE ERKRANKUNGEN.11
1.2.1 AUTOANTIKOERPER UND THROMBOSE.11
1.2.1.1 AUTOANTIKOERPER GEGEN KOMPONENTEN DES GERINNUNGSSYSTEMS.12
1.2.1.2 ANTIPHOSPHOLIPIDANTIKOERPER.12
1.2.2 AUTOANTIKOERPER UND ARTERIOSKLEROSE.16
2 ZIELSETZUNG.18
3 MATERIAL UND METHODEN. 19
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.19
3.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI.19
3.1.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM MINIMASSSTAB.19
3.1.1.2 PLASMIDREINIGUNG ZUR DNA-SEQUENZIERUNG.19
3.1.2 LAMBDA-TECHNIKEN.19
3.1.2.1 PRAEPARATION VON 'PLATING BACTERIA'.19
3.1.2.2 INFEKTION VON BAKTERIEN MIT PHAGEN.20
3.1.2.3 HERSTELLEN VON 'LYSOGEN RECOMBINANTS'.20
3.1.2.4 EXPRESSION DER 'LYSOGEN RECOMBINANTS'.20
3.1.3 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.21
3.1.3.1 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.21
3.1.3.2 LIGIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.21
3.1.3.3 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER ZELLEN.21
3.1.3.4 TRANSFORMATION VON DNA IN E.COLI.21
3.1.4 PCR-TECHNIKEN.22
3.1.4.1 'COLONY'-PCR.22
3.1.4.2 AMPLIFIKATION VON PLASMID-DNA.22
3.1.4.3 RT-PCR.22
3.1.5 DNA-SEQUENZIERUNG.23
3.1.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA.23
3.1.7 NORTHERN BLOT-ANALYSEN.23
3.1.8 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE.24
3.1.9 SCREENEN EINER GENBANK.24
3.2 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.25
3.2.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH SMITH.25
3.2.2 SDS-PAGE.25
3.2.3 PROTEINFAERBUNG.26
3.2.3.1 COOMASSIE-FAERBUNG IN POLYACRYLAMIDGELEN.26
3.2.3.2 AMIDOSCHWARZ-FAERBUNG IN AGAROSEGELEN.26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALT
3.3 IMMUNOLOGISCHE METHODEN.26
3.3.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ.26
3.3.2 IMMUNSCREENING.26
3.3.3 DOPPELIMMUNDIFFUSION.27
3.3.4 IMMUNBLOT.27
3.3.5 'ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY' (ELISA).28
3.3.6 IMMUNAFFINITAETSREINIGUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN.28
3.4 SONSTIGE METHODEN.29
3.4.1 SERUMGEWINNUNG.J.29
3.4.2 REKALZIFIZIERUNG VON PLASMA.29
3.4.3 BESTIMMUNG VON LABORPARAMETEM.29
3.4.4 STATISTISCHE METHODEN.29
3.5 BESCHREIBUNG DER (PATIENTEN-)KOLLEKTIVE.29
4 ERGEBNISSE.32
4.1 FALLBESCHREIBUNG DER INDEXPATIENTIN H.M.32
4.1.1 ANAMNESE UND LABORWERTE.32
4.1.2 AUTOIMMUNDIAGNOSTIK.32
4.2 IMMUNSCREENING EINER EXPRESSIONSGENBANK.33
4.2.1 PRINZIP UND DURCHFUEHRUNG.33
4.2.2 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG.35
4.3 ANALYSE DER IMMUNREAKTIVEN KLONE. 35
4.3.1 SEQUENZA NALYSEN.35
4.3.2 UNTERSUCHUNGEN ZU KLON B.36
4.3.3 EXPRESSION DER REKOMBINANTEN ANTIGENE.37
4.3.3.1 EXPRESSION IM 'LYSOGEN RECOMBINANT'.38
4.3.3.2 EXPRESSION MIT DEM EXPRESSIONSVEKTOR PXA1.38
4.3.4 NACHWEIS DER IMMUNREAKTIVITAET.39
4.3.4.1 WESTERN BLOT.39
4.3.4.2 PRAEINKUBATIONSVERSUCHE.39
4.3.4.3 DOPPELIMMUNDIFFUSION.40
4.3.5 ERSTE SCREENINGS IM WESTERN BLOT-VERFAHREN.41
4.4 EPITOPEINGRENZUNG.41
4.5 ENTWICKLUNG EINES ANTI-CALPASTATIN PEPTID-ELISA.43
4.5.1 TESTETABLIERUNG.43
4.5.2 QUANTIFIZIERUNG DER ANTIKOERPERBINDUNG.44
4.5.3 PRAEZISION DES ELISA.45
4.5.4 FESTLEGUNG DES 'CUTOFF.46
4.5.5 VALIDIERUNG DES ASSAYS.46
4.6 SCREENING VON PATIENTENKOLLEKTIVEN IM ANTI-CALPASTATIN-ELISA.47
4.6.1 ALTERSABHAENGIGKEIT.48
4.6.2 ANTI-CALPASTATIN-TITER IN THROMBOSEPATIENTEN.48
4.6.3 SCREENING WEITERER KOLLEKTIVE.49
4.6.4 VERGLEICH HOCHTITRIGER ANTI-CALPASTATIN-PATIENTEN.51
INHALT
4.6.5 FALLBEISPIEL V.H.51
4.7 REINIGUNG VON POLYKLONALEN ANTI-CALPASTATIN-ANTIKOERPEM.52
4.7.1 PEPTIDKOMPETITION IN WESTERN BLOT UND ELISA.52
4.7.2 SPEZIFISCHE REINIGUNG VON ANTI-CALPASTATIN MIT PEPTIDGEKOPPELTEN
BEADS.54
4.8 EPITOPCHARAKTERISIERUNG.55
4.8.1 HERSTELLUNG, EXPRESSION UND IMMUNREAKTIVITAETEN VON
CALPASTATIN-MUTANTEN.55
4.8.1.1 AUSTAUSCH VON AMINOSAEURERESTEN.55
4.8.1.2 ANFUEGEN EINER CARBOXYTERMINALEN AMINOSAEURE.56
4.8.2 HOMOLOGIESUCHE MIT EPITOPMOTIV. 57
4.9 ISOLIERUNG UND EXPRESSION VON CALPASTATIN (GESAMTMOLEKUEL).57
4.9.1 RT-PCR UND KLONIERUNG.58
4.9.2 EXPRESSION UND IMMUNBLOT.59
4.9.2.1 BINDUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER (MAK).60
4.9.2.2 REAKTIONEN VON PATIENTENSEREN.60
4.9.2.3 EINGRENZUNG WEITERER AUTOANTIKOERPERBINDUNGSBEREICHE.61
4.10
WESTERN BLOT SCREENING MIT REKOMBINANTEN CAST-FRAGMENTEN.61
5 DISKUSSION.64
5.1
IDENTIFIZIERUNG EINES AUTOANTIGENS.64
5.2
IMMUNOASSAYS FUER SCREENING-PROZEDUREN.65
5.3 EVALUIERUNG DES ANTI-CALPASTATIN IGG-ELISA. 66
5.4
SCREENING VON PATIENTENGRUPPEN.67
5.4.1 ANMERKUNGEN UND PROBLEME.67
5.4.2 ERGEBNISSE.68
5.5 CALPASTATIN-EPITOPE.
70
5.6
ANTI-CALPASTATIM EIN LITERATURVERGLEICH.71
5.7
ANTI-CALPASTATIN: EIN MARKER FUER EINE AUTOIMMUNERKRANKUNG?.73
5.7.1 DAS CALPAIN-SYSTEM.73
5.7.2 ENTSTEHUNG VON ANTI-CALPASTATIN.75
5.7.3 PATHOGENITAET VON ANTI-CALPASTATIN.76
6 ZUSAMMENFASSUNG
.78
LITERATURVERZEICHNIS
.79
ABKUERZUNGEN.88
ANHANG.91
A. SEQUENZEN.91
B. OLIGONUKLEOTIDE.94
C. ORGANISMEN UND VEKTOREN.96
DANKSAGUNG
97 |
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