Holdings: Entwicklung und immunologische Charakterisierung eines Antigen-Präsentationssystems auf der Basis virus-ähnlicher Partikel

Entwicklung und immunologische Charakterisierung eines Antigen-Präsentationssystems auf der Basis virus-ähnlicher Partikel:

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Main Author:	Deml, Ludwig 1963- (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	1996
Subjects:	Antigenpräsentation Immunologie Hochschulschrift
Online Access:	Inhaltsverzeichnis
Physical Description:	225 S. Ill., graph. Darst.

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKUERZUNGEN _ _ . _ 8 A. EINLEITUNG . 12 AL. . 12 A.2. VERLAUF EINER HIV-INFEKTION. . . 13 A.2.1. FRUEHE PHASE DER INFEKTION . 13 A.2.2. KLINISCHE INAPPARENZ UND VIRUS-PERSISTENZ . 14 A.2.3. PROGRESSION ZUM VOLLBILD AIDS . 15 A.3. IMMUNPATHOGENESE . 15 A.4. PROBLEME BEI DER ENTWICKLUNG EINES HTV-IMPFSTOFFKANDIDATEN . 17 A.5. TIERMODELLE . 18 A.6. ANFORDERUNGEN AN EINE ERFOLGVERSPRECHENDE HTV VAKZINE. 20 A.6.1. VIRUS-NEUTRALISIERENDE ANTIKOERPER . 21 A.6.2. ZELLVERMITTELTE IMMUNANTWORT . 23 A.6.3. ZYTOKINE UND IMMUNMODULATOREN . 25 A.6.4. MUKOSALE IMMUNANTWORT . 25 A.7. ANTIGENFORMULIERUNGEN . . . . 26 A.7.1. "KLASSISCHE " WEGE DER PROZESSIERUNG UND PRAESENTATION VON ANTIGENEN . 26 A.7.1. 1. DER MHC-KLASSE-II-VERMITTELTE PROZESSIERUNGSWEG ZUR INDUKTION EINER HUMORALEN IMMUNANTWORT . 28 A. 7.1.2. DER MHC-KLASSE-I-VERMITTELTE PROZESSIERUNGSWEG ZUR INDUKTION EINER ZELLVERMITTELTEN IMMUNANTWORT 28 A.7.2. IMMUNISIERUNGSSTRATEGIEN . 29 A.7.2.1. "KLASSISCHE" ANSAETZE ZUR INDUKTION EINER HUMORALEN IMMUNANTWORT. . 29 A.7.2.1.1. REKOMBINANTE ANTIGENE . 29 A.7.2.1.2. SYNTHETISCHE PEPTIDE . 30 A.7.2.1.3. INAKTIVIERTE HL-VIRUSPRAEPARATIONEN . 30 A. 7.2.2. KLASSISCHE ANSAETZE ZUR INDUKTION EINER ZELLVERMITTELTEN IMMUNANTWORT . 31 A.7.2.2.1. REKOMBINANTE VIREN UND BAKTERIEN . 31 A.7.2.2.2. ATTENUIERTE VIREN . 32 A. 7.2.3. NEUE STRATEGIEN ZUR INDUKTION EINER ZELLVERMITTELTEN IMMUNANTWORT . 33 A.7.2.3.1 DNS-IMMUNISIERUNG . 33 A.7.2 3 2. ADJUVANZIEN UND LIPOPROTEINSPHAEREN . 34 A.7.2.3.3. VIRUS-AEHNLICHE PARTIKEL . 34 A.8. EIGENE VORARBEITEN UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT . 36 A.8. 1. HIV-PR55 SASS VIRUS-AEHNLICHE PARTIKEL: EIN HOCHIMMUNOGENES PARTIKULAERES ANTIGEN .36 A.8.2. KONZEPTE ZUR STEIGERUNG DER IMMUNOGENITAET PRSS " 8 VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL . 37 A.8.3. ZIELSETZUNG DER ARBEIT . 41 B. MATERIAL UND METHODEN . 43 B.L. MATERIAL . 43 B.1.1. BAKTERIEN . 43 B. 1 .2. NUKLEINSAEUREN . 43 B.L. 2.1. PLASMIDE . 43 B. 1.2.2. OLIGONUKLEOTIDE . 44 B.L. 3. NAEHRMEDIEN . 45 B.L.3.1. NAEHRMEDIEN FUER BAKTERIEN . 45 INHALTSVERZEICHNIS B.1.3 2. NAEHRMEDIEN FUER EUKARYONTISCHE ZELLEN . 45 B.1.4. EUKAYONTISCHE ZELLINIEN . 46 B.1.5. VIRUSSTAEMME . 47 B.1.6. ANTIKOERPER UND ANTISEREN .47 B.1.7. COMPUTERPROGRAMME UND DATENBANKEN .48 B.2. METHODEN . B.2.1. KULTIVIERUNG UND AUFBEWAHRUNG VON BAKTERIEN . 49 B.2. 1.1. FLIISSIGKULTUREN.49 B.2.1. 2. PLATTENKULTUREN . 49 B.2.1. 3. GLYZERINKULTUREN . 49 B.2.2. ARBEITEN MIT DNS . 49 B.2.2.1 PRAEPARATION UND REINIGUNG VON PLASMID-DNS . 49 B.2.2. 1.1 ISOLIERUNG VON DNS DURCH ALKALISCHE SCHNELLYSE ("MINIPRAEPS") . 49 B.2.2. 1.2. ISOLIERUNG VON DNS UEBER QIAGEN-SAEULEN . 50 B.2.2. 1.3. ISOLIERUNG VON DNS-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN . 50 B.2.2. 2. PRAEPARATION VON ZELLULARER GESAMT-DNS . 51 B 2.2 3. SPALTEN VON DNS MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN . 52 B 2.2.4. LIGATION VON DNS-FRAGMENTEN . 53 B.2.2 5. HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER E. COLI-KULTUREN . 53 B.2.2 6. TRANSFORMATION VON DNS IN BAKTERIENZELLEN . 54 B.2.2 7. IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG REKOMBINANTER BAKTERIENKLONE . 54 B.2.3. NUKLEINSAEURE-NACHWEISTECHNIKEN . 55 B.2.3. 1. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE . 55 B.2.3.2. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) .55 B.2.3. 3. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNS-FRAGMENTEN MITTELS PCR-TECHNIK . 57 B.2.3.4. SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG . 57 B.2.3. 5. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNS . 58 B.2 4. DNS-SEQUENZIERUNG . 58 B.2.5 HERSTELLUNG UND REINIGUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN . 60 B 2.5.1. SYNTHESE UND ABSPALTUNG DER OLIGONUKLEOTIDE . 60 B.2.5.2. REINIGUNG UEBER NAPYY SAEULEN .60 B.2.6. ZELLKULTURTECHNIKEN . 60 B.2.6 1. KULTIVIERUNG VON INSEKTENZELLEN ALS MONOLAYER UND SPINNERKULTUR .60 B.2.6 2. ADAPTION AN "SERUMFREIE" ZELLKULTURMEDIEN.61 B.2.6. 3. KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN ALS MONOLAYER UND SUSPENSIONSKULTUR . 62 B. 2.6.4. BESTIMMUNG DER LEBEND-ZELLZAHL . 62 B.2.6.5. LAGERUNG VON ZELLEN . 62 B.2.6 6. HERSTELLUNG STABIL TRANSFIZIERTER DROSOPHILA-SCHNEIDER-2 ZELLINIEN . 63 B.2 6.6 1. UEBERSICHT UEBER DAS DROSOPHILA-EXPRESSIONSSYSTEM . 63 B. 2.6.6.2. TRANSFEKTION VON DS-2 ZELLEN UND ETABLIERUNG STABIL TRANSFIZIERTER ZELLINIEN . 63 B.2.6.6.3. ETABLIERUNG VON KLONALEN DS-2 ZELLINIEN . 64 B.2.6.6 4 INDUKTION DER ANTIGENPRODUKTION . 65 B.2.6.7. HERSTELLUNG REKOMBINANTER BAKULOVIREN .65 B. 2.6.7.1. UEBERSICHT . 65 B.2.6.7.2. INFEKTION VON SF-9 ZELLEN UND LAGERUNG VON VIRUSSTAMMLOESUNGEN . 66 B.2.6.7.3. HERSTELLUNG REKOMBINANTER BAKULOVIREN . 66 B.2.6.7.4. TITRATION UND SELEKTION REKOMBINANTER BAKULOVIREN . 67 B.2.6.7. 5. CHARAKTERISIERUNG REKOMBINANTER BAKULOVIREN AUF DNS UND PROTEINEBENE .67 B 2.6.8. HERSTELLUNG UND TITRATION VON HIV-1 VIRUSSTOCKS .67 B. 2.6.9. VIRUSNEUTRALISATIONSTEST . 68 B 2.6 10. NACHWEISS ZYTOTOXISCHER T-ZELLEN .69 B.2.6. 10.1. IN VITRO EXPANSION VON IN VIVO SENSIBILISIERTEN CTL-POPULATIONEN . 69 B.2.6. 10.2. IN VITRO SENSIBILISIERUNG VON ZIELZELLEN FUER ZYTOTOXISCHE T-ZELLEN .69 B.2 6.10 3. BEHANDLUNG VON ZIELZELLEN MIT HEMMSTOFFEN DER ANTIGENPROZESSIERUNG UND PRAESENTATION . 70 B.2.6. 10.4. 51 CR-FREISETZUNGSTEST . 70 B.2.7. EXPRESSION, REINIGUNG UND ANALYSE VON REKOMBINANTEN PROTEINEN . 70 4 INHALTSVERZEICHNIS B.2.7.1. EXPRESSION REKOMBINANTER ANTIGENE .70 B.2.7.1. 1. EXPRESSION MIT STABIL TRANSFIZIERTEN DROSOPHILA-SCHNEIDER-2 ZELLEN . 70 B.2.7.1.2. EXPRESSION MIT REKOMBINANTEN BAKULOVIREN . 71 B.2.7.2. AUFREINIGUNG REKOMBINANTER ANTIGENE . 71 B.2.7.2. 1. ANREICHERUNG UEBER FILTERMEMBRANEN . 71 B.2.7.2.2. POLYETHYLENGLYCOL (PEG)-FAELLUNG . 71 B. 2.7.2.3. ANREICHERUNG UEBER SACCHAROSEKISSEN . 71 B. 2.7.2.4. REINIGUNG UEBER SACCHAROSE-DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION . 72 B.2.7.2.5. GLEICHGEWICHTSZENTRIFUGATION . 72 B.2.7.2.6. REINIGUNG UEBER PRAEPARATIVE SDS-PAGE SAEULEN (PREP-CELL) .72 B.2.7.2.7. DENATURIERUNG VON VIRUS-AEHNLICHEN PARTIKELN MIT SDS .72 B.2 7.3. ANALYSE REKOMBINANTER ANTIGENE . 73 B.2.7.3. 1 HERSTELLUNG VON ZELLYSATEN . 73 B.2 7.3.2. AZETONFAELLUNG . 73 B.2.7.3. 3. QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG MIT DEM PROTEIN-ASSAY DER FIRMA BIO-RAD . 73 B.2.7.3.4. AUFTRENNUNG VON PROTEINEN UEBER SDS-POLYACRYLAMID-GELELKTROPHORESE.(SDS-PAGE) . 73 B.2.7.3.5. ANFAERBUNG VON SDS-GELEN MIT COOMASSIE BRILLANT BLAU . 74 B 2.7.3.6. ANFARBEN VON PROTEINEN MIT SILBERNITRAT . 75 B 2.7.3.7. PROBENVORBEREITUNG FUER DIE ELEKTRONENMIKROSKOPIE . 75 B.2.8. SEREN UND ANTIKOERPER . 75 B.2.8.1. IMMUNISIERUNG VON VERSUCHSTIEREN . 75 B.2.8. 1.1. IMMUNISIERUNG VON BALB/C MAEUSEN . 75 B.2.8. 1.2. IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN . 76 B.2.8. 1.3. IMMUNISIERUNG VON RHESUS MAKAKEN . 76 B.2.8.2. SERUMPRAEPARATION AUS VOLLBLUT . 76 B.2.9. IMMUNOLOGISCHE ANALYSEN . 77 B.2.9.1. WESTERN BLOT ANALYSE (IMMUNO-BLOTTING) . 77 B.2.9.2. KOMMERZIELLE TESTKITS ZUM NACHWEISS VON ANTIKOERPERN UND REKOMBINATEN ANTIGENEN . 78 B.2.9.2. 1. BESTIMMUNG HBSAG-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER . 78 B.2.9.2.2. NACHWEIS DES P24-KAPSIDPROTEINS IM CAPTURE-ASSAY . 78 B.2.9.2.3. NACHWEIS DES HBS-ANTIGENS IN EINEM MEIA-TEST .79 B.2.9.3 IMMUNPRDZIPITATION . 79 B.2.9.4. IMMUNOGOLDFAERBUNG . 79 B.2.9.5. DURCHFLUSSZYTOMETRIE. . 80 B.2.9.6. ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) . 80 C. ERGEBNISSE. . 82 C.L. IMMUNOLOGISCHE AUSTESTUNG EINES HIV-VAKZINEKANDIDATEN AUF DER BASIS ANTIGENETISCH ERWEITERTER PRSS 8 * 8 VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL . 82 C. 1.1. EXPRESSION, REINIGUNG UND IMMUNOLOGISCHE AUSTESTUNG TYP-I-VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL (TYP-I-VLPS) . 82 C.L. 1.1. EXPRESSION VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL IN INSEKTENZELLEN UNTER VERWENDUNG DES BAKULOVIRUS EXPRESSIONSSYSTEMS . 82 C.L. 1.2. AUSGANGSKONSTRUKTE . 83 C.L. 1.3. ETABLIERUNG REKOMBINANTER BAKULOVIREN . 85 C.L. 1.4. EXPRESSION UND BIOCHEMISCHE ANALYSE PR55CD4SBR CHIMAERER POLYPROTEINE IN INSEKTENZELLEN . 85 C.L. 1.5. REINIGUNG VON TYP-I-VLPS ZUR VERWENDUNG IN IMMUNISIERUNGSSTUDIEN . 90 C.L. 1.6. AUSTESTUNG DER IMMUNOGENITAET VON TYP-I-VLPS IM KLEINTIERMODELL . 91 C. 1.1.6.1. INDUKTION HIV-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER IN KANINCHEN . 91 C. 1.1.6.2. NEUTRALISATION DES HOMOLOGEN VIRUSISOLATS . 95 C. 1.1.6.3. INDUKTION ZYTOTOXISCHER T-ZELLEN DURCH TYP-I-VLPS . 95 C.L. 1.7. PROZESSIERUNG UND MHC-KLASSE-L-BELADUNG VON CHIMAEREN TYP-1 VLPS IN VITRO . 101 C.L. 1.8. KURZZUSAMMENFASSUNG . 103 C.1.2. EXPRESSION, REINIGUNG UND IMMUNOLOGISCHE AUSTESTUNG PRSS^/ENV CHIMAERER VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL (TYP-II-VLPS) . 104 5 INHALTSVERZEICHNIS C. 1.2.1 EXPRESSION UND BIOCHEMISCHE ANALYSE VON TYP-II-VLPS AUS INSEKTENZELLEN . 104 C.L.2.2. REINIGUNG DER TYP-II-VLPS ZUR VERWENDUNG IN IMMUNISIERUNGSSTUDIEN . 113 C.L. 2.3. AUSTESTUNG DER IMMUNOGENITAET DER VLPS IM KLEINTIERMODELL .114 C. 1.2.3.1. INDUKTION HIV-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER . 114 C. 1.2.3.2. NEUTRALISTION DES HOMOLOGEN HIV-ISOLATES . 117 C.L. 2.3.3. INDUKTION EINER MHC-KLASSE-I-VERMITTELTEN ZYTOTOXISCHEN T-ZELLANTWORT . 117 C. 1.2.4. KURZZUSAMMENFASSUNG .123 C.L. 3. VERGLEICHENDE IMMUNOLOGISCHE AUSTESTUNG VON TYP-I UND TYP-II-VLPS IN RHESUS MAKAKEN . 124 C.1.3 1. HUMORALE IMMUNANTWORT . 124 C.L. 3 2. NEUTRALISATION DES HOMOLOGEN VIRUSISOLATS . 127 C. 1.3 3. INDUKTION ZYTOTOXISCHER T-ZELLEN .127 C.L.3.4. BELASTUNG MIT SHIV-VIREN .128 C.L. 3.5. KURZZUSAMMENFASSUNG .128 C.2. ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES EUKARYONTISCHEN EXPRESSIONSSYSTEMS AUF DER BASIS STABIL TRANSFIZIERTER DROSOPHILA-SCHNEIDER-2 INSEKTENZELLEN. .129 C.2. 1. EXPRESSION VON FREMDGENEN IN DS-2 ZELLEN . 129 C.2.2. DAS HBSAG-REPORTERSYSTEM . 130 C.2.3. ETABLIERUNG STABIL TRANSFIZIERTER, KLONALER DS-2 ZELLINIEN . 132 C.2.3. 1. KLONIERUNG DER DS-2 EXPRESSIONSVEKTOREN .133 C.2.3. 2. TRANSFEKTION VON DS-2 ZELLEN .134 C.2.3. 3. SELEKTION STABIL TRANSFIZIERTER ZELLINIEN . 136 C.2.3.4. BESTIMMUNG DER EXPRESSIONSRATEN DES HBSAG-REPORTER-PROTEINS . 137 C.2.3 5. ETABLIERUNG VON KLONALEN ZELLINIEN . 140 C.2.3.6. KURZZUSAMMENFASSUNG .142 C.2.4. ANALYSE STABIL TRANSFIZIERTER DS-2 ZELLEN AUF DNS-EBENE . 142 C.2.4. 1. NACHWEISS DES FREMDGENS IN ZELLULAERER GESAMT-DNS . 142 C.2.4 2 BESTIMMUNG DER KOPIENZAHL .144 C.2.4.3 NACHWEIS DER INTEGRATION DER EXPRESSIONSPLASMIDE IN DAS GENON DER ZIELZELLE . 146 C.2.4.4. KURZZUSAMMENFASSUNG .151 C.2.5. EXPRESSION UND REINIGUNG UND BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DES HBS-ANTIGENS AUS STABILEN DS-2 ZELLINIEN . 152 C.2.5. 1. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DES KLEINEN HBS-ANTIGENS AUS STABILEN DS-2 ZELLINIEN . 152 C.2.5 2. REINIGUNG DER HBSAG-PARTIKEL . 156 C.2 5.3. KURZZUSAMMENFASSUNG . 162 C.2.6. IMMUNOGENITAET DER IN DS-2 ZELLEN PRODUZIERTEN HBSAG LIPOPROTEINPARTIKEL IN KLEINEN LABORTIEREN . 162 C.2.6.I. VERSUCHSANORDNUNG . 162 C.2. 6.2. INDUKTION EINER HUMORALEN IMMUNANTWORT . 162 C.2.6.3 INDUKTION EINER ZELLVERMITTELTEN IMMUNANTWORT. . 163 C.2.6.4. KURZZUSAMMENFASSUNG . 165 D. DISKUSSION _ . _ _ . _ _ 166 D.L. NOTWENDIGKEIT DER ENTWICKLUNG NEUER HIV-VAKZINEKONZEPTE . .166 D.2. HERSTELLUNG ANTIGENETISCH ERWEITERTER PR55 SAG VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL (VLPS) IN INSEKTENZELLEN. 168 D.2.1. TYP-I-VLPS: ANTIGENETISCHE ERWEITERUNG DER PR55 FID -VLPS DURCH DAS EINBRINGEN VON FREMD SEQUENZEN IN DAS PARTIKELBILDENDE POLYPROTEIN . 168 D.2.2. TYP-II-VLPS: ANTIGENETISCHE ERWEITERUNG DER PR55 SAS -PARTIKEL DURCH EINE STABILE VERANKERUNG VON FREMDPROTEINEN AUF DER OBERFLAECHE DER VLPS . 171 D.3. IMMUNOGENITAET VON ANTIGENETISCH ERWEITERTEN TYP-I UND TYP-II-VLPS IN KLEINEN LABORTIEREN . 173 D.3. 1. INDUKTION HIV-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER . 173 D.3.2. INDUKTION ZYTOTOXISCHER T-ZELLEN DURCH EXOGENE, NICHT REPLIZIERENDE LIPOPROTEINPARTIKEL . 177 D.4. MECHANISMEN DER ANTIGENPROZESSIENING UND PRAESENTATION CHIMAERER PR55 EAS -VLPS.L79 6 INHALTSVERZEICHNIS D.5. IMMUNOGENITAET ANTIGENETISCH ERWEITERTER VIRUS-AEHNLICHER PARTIKEL IN MAKAKEN . 181 D.6. EIGNUNG DES STABILEN DROSOPHILA-SCHNEIDER-2 EXPRESSIONSSYSTEMS ZUR HERSTELLUNG VON LIPOPROTEIN-PARTIKELN . 184 D.6. 1. TRANSFEKTION VON ZELLEN UND ERZEUGUNG STABIL TRANSFIZIERTER EINZELZELLKLONE . 184 D.6.2 BILDUNG KOMPLEXER LIPOPROTEIN-PARTIKEL IN DS-2 INSEKTENZELLEN . 187 D.6.3 IMMUNOGENITAET DER IN DS-2 ZELLEN HERGESTELLTEN PARTIKULAEREN ANTIGENE IN KLEINEN LABORTIEREN . 189 D.7. ZUSAMMENFASSUNG . 190 D.8. AUSBLICK . 194 LITERATURVERZEICHNIS. ----- . - . . 196 VEROEFFENTLICHTE ARBEITEN . .220 DANKSAGUNG. 224 LEBENSLAUF _ _ . _ _ . ------------------------- 225 7
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