Bedeutung funktionell wichtiger Bereiche innerhalb des gruppenspezifischen Antigens für die Morphogenese und Replikation von HIV-1:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | IV, 191 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS
DER
IM
TEXT
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
.
_
.
1
ZUSAMMENFASSUNG.
.
5
A.
EINLEITUNG
.
8
A.L
DIE
FAMILIE
DER
RETROVIREN
.
8
A.1.1
HISTORISCHES
.
8
A.
1.2
GENERELLE
EIGENSCHAFTEN
DER
RETROVIREN
.
9
A.
1.3
TAXONOMIE
DER
RETROVIREN
.
11
A
.2
DAS
HUMANE
IMMUNDEFLZIENZ
VIRUS
(HIV)
.
.12
A.2.1
EPIDEMIOLOGIE
DER
HIV-INFEKTION
.
12
A.2.2
MOLEKULARER
AUFBAU
VON
HIV-1
.
13
A.2.2.1
AUFBAU
REIFER
HIV-VIRIONEN
.
13
A.2.2.2
GENOMSTRUKTUR
VON
HIV-1
.
15
A.2.3
VERMEHRUNGSZYKLUS
VON
HIV-1
.
17
A.2.3.
1
FRUEHE
STADIEN
DER
VIRUSINFEKTION
.
17
A.2.3.2
REGULATION
DER
VIRALEN
GENEXPRESSION
.
20
A.2.3.3
VIRUSMORPHOGENESE
.
21
A.2.4
BEDEUTUNG
DER
GAG-PROTEINE
WAEHREND
FRUEHER
STADIEN
DER
INFEKTION
.
29
A.3
STRUKTUR-FUNKTIONSBEZIEHUNGEN
FUER
DAS
GAG-POLYPROTEIN
AUF
DER
BASIS
ORTSGERICHTETER
MUTGENESE
.31
A.4
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
33
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
36
B.L
MATERIAL.
.
36
B.1.1
BAKTERIEN
.
36
B.L.
2
PLASMIDE
.
36
B.L.
3
OHGONUKLEOTIDE
.
37
B.L.
4
NAEHRMEDIEN
.
40
B.
1.4.1
NAEHRMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
.
40
B.
1.4.2
NAEHRMEDIEN
FUER
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
.
41
B.L.
5
EUKARYONTISCHE
ZELLINIEN
.
42
B.
1.6
ANTIKOERPER
UND
SEREN
.
42
B.L.
7
EDV
PROGRAMME
.
43
B.2
METHODEN
.
44
B.2.1
KLONIERUNG
IN.
COLI
.
44
B.2.
1.1
KULTIVIERUNG
UND
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
.
44
B.2.
1.1.1
FLUESSIGKULTUREN
.44
B.2.
1.1.2
PLATTENKULTUREN
.44
B.2
1.1.3
GLYCENNKULTUREN
.44
B.2.
1.2
ISOLIERUNG
VON
DNS
.
44
B.2.1.2.1
ISOLIERUNG
VON
DNS
DURCH
ALKALISCHE
SCHNELLLYSE
.44
B.2.
1.2
2
ISOLIERUNG
VON
DNS
UBERQUIAGEN-SAEULEN
.
45
B.2.
1.2.3
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
.46
B.2.
1.2.4
PRAEPARATION
VON
ZELLULAERER
GESAMT-DNS
.46
B.2
1.3
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNS
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
47
B.2.
1.4
LIGATION
VON
DNS
FRAGMENTEN
.
47
B.2.
1.5
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
.
48
B.2.
1.6
TRANSFORMATION
VON
DNS
IN
BAKTENENZELLEN
.
.
49
B.2.
1.7
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
BAKTERIENKLONE
.
50
INHALTSVERZEICHNIS
B.2.2
DNS-NACHWEISTECHNIKEN
.
50
B.2.2.
1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
50
B.2
2.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
52
B.
2.2.3
NICHT-RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNS
.
52
B.2
2
4
SOUTHERN-BLOT
.
53
B.
2.2.5
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNS
.
54
B.2.
3
DNS-SEQUENZIERUNG
.
54
B.2.4
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
56
B.2.4
1
SYNTHESE
UND
ABSPALTUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.
56
B.2.4
.2
REINIGUNG
UEBER
NAP-SAEULEN
.
56
B.2.5
SEQUENZSPEZIFISCHE
MUTGENESE
.
57
B.2.
5.1
SEQUENZSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
IN
DS
DNS
UNTER
VERWENDUNG
DER
PCR
.
57
B.2.5.
2
SEQUENZSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
M
DS
DNS
UNTER
VERWENDUNG
DES
CHAMELEON
DOUBLE-STRANDED,
SITE
DIRECTED
MUTAGENESIS-KITS(STRATAGENE,
HEIDELBERG)
.
57
B.2.6
EXPRESSION
VON
REKOMBMANTEN
PROTEINEN
IN
E
COLI
.
59
B.2.6
1
EXPRESSION
IN
E.COLI
.
59
B.2.6.2
AFFINITAETSREINIGUNG
UEBER
GLUTATHION
SEPHAROSE
IM
BATCH-VERFAHREN
.
60
B.2.6.2.1
ZELLAUFSCHLUSS
.60
B.2.6.2
2
AFFINITATSREINIGUNGDES
GST-CYCLOPHILIN-FUSIONSPROTEINS
UEBER
GLUTATHION
SEPHAROSE
IM
BATCH-VERFAHREN.
.60
B.2.6.3
PROTEINMENGENBESTIMMUNG
.
61
B.
2.6.4
BINDUNG
VON
PRSS
8
"'
8
PROTEINEN
AN
GST-CYCLOPHILIN-FUSIONSPROTEINEN
.
61
B.2.7
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
UND
VIRUSPARTIKELN
IN
EUKARYONTENZELLINIEN
.
63
B.2.7.1
ZELLKULTURTECHNIKEN
.
63
B.2.7.2
HERSTELLUNG
REKOMBMANTER
HL-VIREN
.
64
B.2
7.2.1
ELEKTROTRANSFEKTION
VON
COS-7
ZELLEN
.64
B.2
7.2.2
TRANSFEKTION
VON
CEM4
ZELLEN
MITTELS
DEAE-DEXTRAN
.
65
B.2
7.2
3
INFEKTION
VON
HUMANEN
T-ZELLINIEN
(MT4,
MT2,
CEM4,
H9)
.66
B.2.7.
3
GEWINNUNG
VON
HL-VIREN
UEBER
SACCHAROSE-KISSEN-ZENTRIFUGATION
.
66
B.2.7
.4
HERSTELLUNG
VON
ZELLYSATEN
.
66
B.2.7
.5
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
67
B.2.7
6
ANFAERBEN
VON
SDS-GELEN
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLAU
(COOMASSIEBLAU)
.
67
B.2.7.
7
IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISMETHODEN
.
68
B
2.7.7.1
NACHWEIS
UND
QUANTIFIZIERUNG
DES
P24-KAPSID-ANTIGENS
MITTELS
P24
SANDWICH-TEST
(ABBOTT,
WIESBADEN)
.68
B
2.7.7
2
WESTERN
BLOT
ANALYSE
VON
SDS-POLYACRYLAMTDGELEN
.
68
B.2.7
7.3
NACHWEIS
VIRALER
PROTEINE
M
ZELLEN
UEBER
IMMUNFLUORESZENZ
.
69
B.2.7.8
QUANTIFIZIERUNG
VON
FREIGESETZTEN
VIRUSPARTIKELN
UEBER
VIRUSASSOZIIERTE
REVERSE
TRANSKRIPTASE-AKTIVITAET
.
70
B.
2.7.9
ANALYSE
UEBER
SACCHAROSE-GRADIENTEN-ZENTNFUGATION
.
70
B
2.7.9.1
ANALYSE
UEBER
GLEICHGEWICHTSZENTRIFUGATION
.
70
B
2.7.9
2
ANALYSE
UEBER
GESCHWINDIGKEITSGRADIENTEN
.
71
B.2.7.
10
ANALYSE
FRUEHER
STADIEN
DER
VIRALEN
REPLIKATION
IN
MT4
ZELLEN
.
71
B.2.7.
11
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DIE
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
72
B
2.7.12
QUANTITATIVER
NUKLEINSAEURENACHWEIS
DER
VIRUS-ASSOZIIERTEN
RNS
(B-DNA-ASSAY
DER
FIRMA
CHIRON)
.
73
C.
ERGEBNISSE
.
74
C.L
KONZEPT
.
_
C.2
ERZEUGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
PROVIREN
MIT
AUSGESUCHTEN
DELETIONEN
IN
DER
GAG-KODIERENDEN
SEQUENZ
VON
HIV-1
IIXBJ
.78
C.2.1
AUSGANGSUBERLEGUNGEN
.
78
C.2.
2
IN
VITRO
MUTAGENESE
UNTER
VERWENDUNG
DER
PCR
.
79
C
2.3
INSERTION
DER
PCR-PRODUKTE
IN
DEN
BAKTERIELLEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PLIN8PR55GAGA2
.
80
C.2.4
EXPRESSION
DER
DELETIONSMUTANTEN
IN
E.
COLI
.
82
C.2.
5
INSERTION
DER
DELETIONEN
IN
DAS
PROVIRALE
PLASMID
PSP65/HXB2
.
83
C.2.6
TRANSFEKTION
VON
PROVIRUSKONSTRUKTEN
MIT
AUSGESUCHTEN
DELETIONEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
85
C.2.7
FREISETZUNG
VON
REKOMBINANTEN
VIRUSPARTIKELN
AUS
COS-7
ZELLEN
.
85
INHALTSVERZEICHNIS
C.2.8
INFEKTIOSITAET
DER
REKOMBINANTEN
VIRUSPARTIKEL
IN
VERSCHIEDENEN
T-HELFERZELLINIEN
.
87
C.2.9
ZUSAMMENFASSUNG
DER
CHARAKTERISIERUNG
AUSGESUCHTER
DELETIONSMUTANTEN
.
89
C.3
ERZEUGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
PROVIREN
MIT
SUBSTITUTIONEN
GELADENER
AMINOSAEUREN
IM
MATRIXPROTEIN
VON
HIV-1HXB2
.
90
C.3.1
VORBEMERKUNGEN
.
90
C.3.2
IN
VITRO
MUTAGENESE
UNTER
VERWENDUNG
DES
CHAMELEON
DOUBLE-STRANDED-KITS.
91
C.3.3
INSERTION
DER
MUTIERTEN
SEQUENZEN
IN
DAS
PROVIRALE
PLASMID
PSP65/HXB2
.
93
C.3.4
TRANSFEKTION
DER
REKOMBINANTEN
PROVIRUSKONSTRUKTE
E105-107A
UND
KL
10,112-1
14T
IN
COS-7
ZELLEN
.95
C.3.5
FREISETZUNG
REKOMBINANTER
VIRUSPARTIKEL
AUS
COS-7
ZELLEN
.
95
C.3.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
VIRUSREIFUNG
.
96
C.3.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
PARTIKELDICHTE
UND
-GROSSE
UEBER
SACCHAROSE-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
99
C.3.
8
REPHKATIONSVERHALTEN
DER
REKOMBINANTEN
VIRUSPARTIKEL
IN
MT4
LYMPHOZYTEN
.
101
C.3.9
CHARAKTERISIERUNG
FRUEHER
STADIEN
DES
VIRALEN
LEBENSZYKLUS
.
102
C.3.
10
ZUSAMMENFASSUNG
DER
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
PROVIREN
MIT
SUBSTITUTIONEN
VON
GELADENEN
AMINOSAEUREN
IM
MATRIXPROTEIN
.
105
C.4
ERZEUGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
PROVIREN
MIT
AUSGESUCHTEN
PROLINSUBSTITUTIONEN
IN
DER
AMINOTERMINALEN
DOMAENE
DES
KAPSIDPROTEINS
VON
HIV-1
.
105
C.4.1
VORBEMERKUNGEN
.
105
C.4.2
IN
VITRO
MUTAGENESE
UNTER
VERWENDUNG
DES
CHAMELEON
DOUBLE-STRANDED-KITS
.
109
C.4.
3
INSERTION
DER
MUTIERTEN
SEQUENZEN
IN
DAS
PROVIRALE
PLASMID
PSP65/HXB2
.
111
C.4.4
TRANSFEKTION
VON
PROVIRUSKONSTRUKTEN
MIT
AUSGESUCHTEN
SUBSTITUTIONEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
111
C.4.5
FREISETZUNG
REKOMBINANTER
VIRUSPARTIKEL
AUS
COS-7
ZELLEN
UND
DER
VERGLEICH
ZWISCHEN
KONSERVATIVEN
UND
NICHT
KONSERVATIVEN
PROLINAUSTAUSCHEN
.
112
C.4.
6
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
VERHAELTNIS
ZWISCHEN
ZELL-GEBUNDENEM
UND
PARTIKEL-ASSOZIIERTEM
P24-ANTIGEN
.
114
C.4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
VIRUSREIFUNG
.
116
C.4.
8
CHARAKTERISIERUNG
DER
PARTIKELDICHTE
UND
-GROSSE
UEBER
SACCHAROSE-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
119
C.4.9
REPLIKATIONSVERHALTEN
DER
REKOMBINANTEN
VIRUSPARTIKEL
IN
MT4
UND
CEM4
LYMPHOZYTEN
.
123
C.4.
10
EINBAU
DES
GLYKOSYLIERTEN
HUELLPROTEINS
GPL20
"
'
UND
DER
VIRALEN
GENOMISCHEN
RNS
IN
REKOMBINANTE
VIRUSPARTIKEL
.
126
C.4.
11
CHARAKTERISIERUNG
DER
BINDUNGSAFFINITAET
VON
REKOMBINANTEN
PR55GAG-POLYPROTEINEN
FUER
DAS
ZELLULAERE
CHAPERON
CYCLOPHILIN
.
127
C.4.
11.1
VORBEMERKUNGEN
.
127
C.4.1
1.2
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
GST-CYPA-FUSIONSPROTEINS
AUS
E
COLI
.
128
C.4.
11.3
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
PR55GAG-POLYPROTEINE
.
128
C.4.
11.4
BINDUNG
DER
REKOMBINANTEN
PR55GAG-POLYPROTEINE
AN
CYCLOPHILIN
.
129
C.4.1
1.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNGSKAPAZITAET
EINZELNER
PROLINSUBSTITUTIONSMUTANTEN
.
129
C.4.1
1.6
KURZZUSAMMENFASSUNG
ZUR
AFFINITAET
AUSGESUCHTER
MUTATIONEN
ZU
DEM
ZELLULAEREN
CHAPERON
CYCLOPHILIN
A
.
132
C.4.
12
CHARAKTERISIERUNG
FRUEHER
STADIEN
DES
VIRALEN
REPLIKATIONSZYKLUS
.
132
C.4.12.1
VORBEMERKUNG
.
132
C.4.12.2
INFEKTION
VON
MT4
ZELLEN
MIT
AUSGESUCHTEN
PROLINSUBSTITUTIONSMUTANTEN
UND
PCR-ANALYSE
DER
REVERSEN
TRANSKRIPTION
.
133
C.4.
12.3
NACHWEIS
BESTIMMTER
PCR
PRODUKTE
UEBER
SOUTHERN
BLOT
MIT
DIGOXYGENIN
MARKIERTEN
DNS-SONDEN
.
135
C.4.
13
ANALYSE
AUSGESUCHTER
PROLINSUBSTITUTIONEN
UEBER
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
137
C.4.
14
ZUSAMMENFASSUNG
DER
CHARAKTERISIERUNG
VON
AUSGESUCHTEN
PROLINSUBSTITUTIONSMUTANTEN
.
138
D.
DISKUSSION
_
_
141
D.L
PATHOGENESE
DER
HIV-INFEKTION
UND
ANSAETZE
FUER
DIE
THERAPIE
DER
HIV-ERKRANKUNG
.
141
D.2
FUNKTIONSANALYSEN
DES
GAG-POLYPROTEINS
.
144
D.3
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DES
MATRIX-UND
DES
KAPSIDPROTEINS
.
145
INHALTSVERZEICHNIS
D.4
CHARAKTERISIERUNG
DES
GAG-POLYPROTEINS
MIT
HILFE
UEBERLAPPENDER
DELETIONEN
.
149
D.5
DIE
BEDEUTUNG
GELADENER
AMINOSAEURERESTE
IM
C-TERMINUS
DES
MATRIXPROTEINS
.
151
D.6
DIE
BEDEUTUNG
KONSERVIERTER
PROLINRESTE
FUER
KONFORMATIONSABHAENGIGE
FUNKTIONEN
DES
KAPSIDPROTEINS
.
153
D.6.1
PROLINSUBSTITUTIONEN
MIT
EINEM
EINFLUSS
AUF
DIE
SPAETEN
STADIEN
DER
VIRUSMORPHOGENESE
.
154
D.6.
2
DIE
BEDEUTUNG
KONSERVIERTER
PROLINRESTE
FUER
DIE
FRUEHEN
STADIEN
DER
VIRUSREPLIKATION
.
156
D.7
DIE
AMINOTERMINALE
DOMAENE
DES
KAPSIDPROTEINS
ALS
GRUNDLAGE
EINER
KORREKTEN
CORE-MORPHOLOGIE.
162
D.8
AUSBLICK
.
166
D.8.
1
WEITERFUEHRENDE
UNTERSUCHUNGEN
.
166
D.8.
2
EINSATZMOEGLICHKEITEN
IN
DER
KLINISCHEN
FORSCHUNG
.
1
67
LITERATURVERZEICHNIS
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VEROEFFENTLICHUNGEN.
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DANKSAGUNG
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