Die Glutaryl-7-ACA-Acylase aus Pseudomonas sp. ATCC 53891: Mutagenese, katalytische Eigenschaften und Processing
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| adam_text | DIE GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE AUS PSEUDOMONAS SP. ATCC 53891: MUTAGENESE,
KATALYTISCHE EIGENSCHAFTEN UND PROCESSING VOM FACHBEREICH BIOLOGIE DER
UNIVERSITAET KAISERSLAUTEM ZUR VERLEIHUNG DES AKADEMISCHEN GRADES DOKTOR
DER NATURWISSENSCHAFTEN GENEHMIGTE DISSERTATION VORGELEGT VON MARIJKE
WEBER AUS BERLIN DATUM DER WISSENSCHAFTLICHEN AUSSPRACHE: 18. JULI 1996
VORSITZENDER: PROF. DR. H. HUBER 1. BERICHTERSTATTER: PD DR. B. HENRICH
2. BERICHTERSTATTER: PROF. DR. T. ANKE KAISERSLAUTERN 1996 (D386)
INHALTSVERZEICHNIS EINLEITUNG MATERIAL BAKTERIEN PLASMIDE NAEHRMEDIEN UND
PUFFER NAEHRMEDIEN ANTIBIOTIKAZUSAETZE PUFFER CHEMIKALIEN ENZVME GERAETE
METHODEN MIKROBIOLOGISCHE METHODEN STAMMKONSERVIERUNG KULTURBEDINGUNGEN
MESSUNG DES BAKTERIENWACHSTUMS UEBERPRUEFUNG VON AMINOSAEUREAUXOTROPHIEN
WACHSTUMSVERSUCHE MIT PEPTIDDERIVATEN AGARPLATTENTEST 1 8 8 9 9 9 10 II
II 12 12 13 13 13 13 13 13 14 14 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.4 2.4.1
2.4.2 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.5.1 3.1.5.2 FLUESSIGTEST 14
3.1.6 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA COLI 14 3.1.6.1 PRAEPARATION UND
TRANSFORMATION KOMPETENTER ZELLEN 14 3.1.6.2 ELEKTROPORATION
(ELEKTROTRANSFORMATION) VON ESCHERICHIA COLI 15 3.2 PRAEPARATION UND
ANALYSE VON DNA ; 16 3.2.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS ESCHERICHIA
COLI 16 3.2.1.1 MINILYSATE NACH PHARMACIA 16 3.2.1.2 MIDIPRAEPARATION 17
3.2.2 REINIGUNG VON DNA 17 3.2.2.1 PHENOLEXTRAKTION 17 3.2.2.2
ETHANOLPRAEZIPITATION 17 3.2.2.3 PRAEZIPITATION VON DNA MIT ISOPROPANOL 18
3.2.2.4 PRAEZIPITATION VON DNA MIT ISOPROPANOL UND AMMONIUMACETAT 18
3.2.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 18 3.2.4 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG
VON DNA 19 3.2.4.1 VERDAUUNG DURCH RESTRIKTIONSENZYME 19 3.2.4.2
LIGIEREN VON DNA-FRAGMENTEN 19 3.2.4.3 PHOSPHATASEBEHANDLUNG VON
LINEARISIERTER PLASMID-DNA 19 3.2.5 ELEKTROPHORESE VON DNA 20 3.2.5.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE 20 3.2.5.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE [ 20
3.2.5.3 FAERBEN VON DNA-GELEN 21 3.2.5.4 GROESSENBESTIMMUNG VON
DNA-FRAGMENTEN 21 3.2.6 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 22 3.2.6.1
ELEKTROELUTION ; 22 3.2.6.2 *QIAQUICK -GEL-EXTRAKTION 23 3.3 DNA
SEQUENZIERUNG 23 3.3.1 RADIOAKTIVE SEQUENZIERUNG VON DOPPELSTRANG-DNA 23
3.3.2 SEQUENZGELE 23 3.3.2.1 BEHANDLUNG DER GLASPLATTEN FUER SEQUENZGELE
23 3.3.2.2 GIESSEN DER GELE UND GELELEKTROPHORESE 24 3.3.2.3 WAESSERN,
TROCKNEN UND AUTORADIOGRAPHIE DER GELE 25 3.3.3 NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG VON DOPPELSTRANG-DNA 25 3.3.4 SEQUENZANALYSE 26 3.4
MUTAGENESE KLONIERTER DNA 26 3.4.1 MNNG-MUTAGENESE 26 3.4.2 MUTAGENESE
IM MUTATORSTAMM XLL-RED 27 3.4.3 ORTSSPEZIFISCHE PCR-MUTAGENESE 27
3.4.3.1 EINFUEHRUNG DER MUTATION DURCH MUTAGENE OLIGONUKLEOTIDE 27
3.4.3.2 EINFUEHRUNG DER MUTATION DURCH UEBERLAPPENDE PCR 29 3.5 ANALYSE
VON PROTEINEN 31 3.5.1 GEWINNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN 31 3.5.1.1
GEWINNUNG VON ZELLFREIEM EXTRAKT 31 3.5.1.2 OSMOTISCHER SCHOCK NACH
DVORAK 32 3.5.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 32 3.5.3
ELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 33 3.5.3.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELE 33 3.5.3.2
COOMASSIE-FAERBUNG 34 3.5.4 DIALYSE : : 35 3.5.5 RADIOAKTIVE MARKIERUNG
NEUSYNTHETISIERTER PROTEINE 35 3.5.5.1 IN VI RRO-MARKIERUNG
NEUSYNTHETISIERTER PROTEINE 35 3.5.5.2 IN VIVO-MARKIERUNG
NEUSYNTHETISIERTER PROTEINE 36 3.6 BESTIMMUNG DER
GLUTARYL-7-ACA-ACYLASEAKTIVITAET 37 3.6.1 PHOTOMETRISCHE ENZYMTESTS ; 37
3.6.1.1 NINHYDRINFARBLEST ; 37 3.6.1.2 SPALTUNG VON NBHAB : 37 3.6.1.3
SPALTUNG VON NIPAB 38 3.6.1.4 SPALTUNG VON SS-NAPHTHYLAMIDEN 38 3.6.2
HPLC-TESTS ; 39 3.6.2.1 SPALTUNG VON GLUTARYL-L-LEU 39 3.6.2.2 SPALTUNG
VON CEPHALOSPORIN C 39 3.6.3 INHIBITORTESTS 39 3.7 ANALYSENMETHODEN 40
3.7.1 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN 40 3.7.1.1 METHODEN ZUR HPLC-ANALYSE
40 3.7.1.2 3.7.2 3.7.3 3.8 3.9 3.9.1 3.9.1.1 3.9.1.2 3.9.1.3 3.9.2 3.9.3
3.9.4 3.9.4.1 3.9.4.2 3.9.5 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.5.1
4.1.5.2 4.2 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.1.3 4.2.1.4 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4
4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.5 . 4.6 4.6.1 4.6.1.1 4.6.1.2 4.6.1.3 4.6.2
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE H-NMR-SPEKTREN ELEMENTARANALVSEN ENTWICKLUNG
VON ROENTGENFILMEN CHEMISCHE METHODEN DARSTELLUNG VON N-ADIPYL-L-LEUCIN
AKTIVIERUNG DES ADIPINSAEUREMONOMETHYLESTERS KOPPLUNG VON L-LEUCIN AN DEN
ADIPINSAEUREMETHYLESTER ABSPALTUNG DES METHVLESTERS DARSTELLUNG VON
6-BROMHEXANOYL-L-LEUCIN DARSTELLUNG VON N-SUCCINYL-L-LEUCIN DARSTELLUNG
VON *Y-D-GLU-L-LEU AKTIVIERUNG VON D-GLUTAMAT UND KOPPLUNG MIT L-LEUCIN
ABSPALTUNG DER SCHUTZGRUPPEN DARSTELLUNG VON
2-NITRO-5-(6-BROMHEXANOYLAMINO1BENZOESAEURE ERGEBNISSE CHARAKTERISIERUNG
DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE AUS PSEUDOMONAS SP. ATCC 53891
GELELEKTROPHORETISCHE ANALYSE DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE NACHWEIS DES
GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE-VORLAEUFERPROTEINS BESTIMMUNG DES
TEMPERATUROPTIMUMS BESTIMMUNG DES PH-OPTIMUMS SUBSTRATSPEKTRUM DER
GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE SUBSTRATSPEKTRUM SPALTUNG CHROMOGENER SUBSTRATE
WAHL DER SELEKTIONSSUBSTRATE ANALVSE DER SYNTHETISIERTEN VERBINDUNGEN
ELEMENTARANALYSEN UND AUSBEUTEN CHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE
H-NMR-SPEKTREN RETENTIONSZEITEN DER HPLC MUTAGENESE UND SELEKTION
MNNG-MUTAGENESE UND SELEKTION MUTAGENESE IM STAMM XL 1-RED
CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN WACHSTUMSVERHALTEN DER MUTANTEN SPALTUNG
VON CEPHALOSPORIN C UND N-ACYLLEUCINDERIVATEN SPALTUNG VON NBHAB
HOMOLOGIEVERGLEICH VON CEPHALOSPORIN-ACVLASEN ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE
DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE KONSTRUKTION VON PS201A AMPLIFIZIERUNG DES
MUTAGENEN DNA-FRAGMENTES BA547 KLONIERUNG VON BA547 IN PUC18 KLONIERANG
DES AMHI//T*II-FRAGMENTES IN PGL6 KONSTRUKTION VON PS199A 41 41 41 42
42 42 42 43 44 44 45 46 46 47 47 49 _49 49 50 51 52 52 52 54 55 57 57 58
59 59 61 61 62 63 63 64 65 66 67 67 67 68 69 70 4.6.2.1 UEBERLAPPENDE PCR
70 4.6.2.2 KLONIERUNG VON EA802 IN PUC18 : 71 4.6.2.3 KLONIERUNG DES
FCORIMIWII-FRAGMENTES IN PGL6 73 4.7 KONSTRUKTION VON PGL7 73 4.8
CHARAKTERISIERUNG DER MUTEINE S199A UND S201A 74 4.8.1 WACHSTUM VON
M8820(PS199A) UND M8820(PS201A) 74 4.8.2 SPALTUNG CHROMOGENER SUBSTRATE
76 4.9 KATALYSEMECHANISMUS DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE 77 4.10 EXPRESSION
DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE IN E. COLI 79 4.10.1 EXPRESSION DER
GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE UNTER KONTROLLE DES /AC-PROMOTORS 79 4.10.2
UEBERPRODUKTION DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE 81 4.10.2.1 KLONIERUNG DES
GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE-GENS UNTER KONTROLLE DES T7-PROMOTORS 81 4.10.2.2
UEBEREXPRESSION DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE 83 5 DISKUSSION 86 5.1
SUBSTRATSPEKTRUM 86 5.2 MUTAGENESE 89 5.3 HOMOLOGIE DER
GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE AUS PSEUDOMONAS SP. ATCC 53891 ZU ANDEREN
BAKTERIELLEN SS-LACTAM-ACYLASEN __- 89 5.4 ENDOPEPTID 90 5.5 KATALYTISCH
AKTIVES ZENTRUM UND PROCESSING DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE 91 5.5.1
KATALYTISCH AKTIVES ZENTRUM 91 5.5.2 POSTTRANSLATIONALES PROCESSING 93
5.5.3 UEBERPRODUKTION DER GLUTARYL-7-ACA-ACYLASE 93 5.6 CODON-USAGE 95
5.7 SEQUENZIERUNG 95 6 ZUSAMMENFASSUNG 96 7 ANHANG 98 8
LITERATURVERZEICHNIS 100
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