Überleben ohne DEAD?: RNA-Helikasen und RNA-Editing in Trypanosoma brucei
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
LISTE
DER
ABKUERZUNGEN
GLOSSAR
VERZEICHNIS
DER
TABELLEN
UND
ABBILDUNGEN
1
EINLEITUNG
1
1.1
TRYPANOSOMA
BRUCEI
1
1.1.1
TAXONOMIE
UND
PHYLOGENIE
1
1.1.2
MORPHOLOGIE
UND
LEBENSZYKLUS
4
1.1.3
PATHOLOGIE
UND
THERAPIE
6
1.1.4
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
BESONDERHEITEN
IN
TRYPANOSOMA
BRUCEI
7
1.1.4.1
ANTIGENE
VARIATION
8
1.1.4.2
POLYCISTRONISCHE
TRANSKRIPTION
UND
TNANR-SPLICING
9
1.1.4.3
KOMPARTIMENTIERUNG
DER
GLYKOLYSE
IN
GLYKOSOMEN
10
1.2
RNA
EDITING
10
1.2.1
C
ZU
U-KONVERSION
IN
DER
APOB-MRNA
AUS
SAEUGERZELLEN
11
1.2.2
A
ZU
I-KONVERSION
IN
GLUTAMAT-REZEPTOR-MRNAS
AUS
SAEUGERZELLEN
12
1.2.3
PYRIMIDIN-TRANSITION
IN
RNA-MOLEKUELEN
AUS
DEN
ORGANELLEN
HOEHERER
PFLANZEN
13
1.2.4
EDITING
VON
TRNA-MOLEKUELEN
14
1.2.5
EDITING
MITOCHONDRIALER
TRANSKRIPTE
AUS
PKYSARUM
POLYCEPHALUM
15
1.3.
EDITING
IN
KINETOPLASTIDISCHEN
ORGANISMEN
-
KRNA
EDITING
15
1.3.1
DAS
MITOCHONDRIALE
GENOM
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
16
1.3.2
PHAENOMENOLOGIE
DES
KRNA
EDITING
IN
TRYPANOSOMA
BRUCEI
18
1.3.3
MECHANISMUS
DES
KRNA
EDITING
21
1.3.4
PROTEIN-KOMPONENTEN
DES
KRNA
EDIDNG-APPARATS
24
1.4
RNA
HELIKASEN
25
1.4.1
UEBERBLICK
25
1.4.2
RNA
HELIKASEN,
TRANSLATION
UND
RIBOSOMEN-ASSEMBLIERUNG
27
1.4.3
RNA
HELIKASEN
UND
RNA
SPLICING
28
1.4.4
RNA
HELIKASEN
UND
ENTWICKLUNG
28
1.4.5
VIRALE
RNA
HELIKASEN
29
1.4.6
RNA
HELIKASEN
UND
RNA-STABILITAET
30
1.5
PROBLEMSTELLUNG
31
2
ERGEBNISSE
32
2.1
EINE
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
IM
MITOCHONDRIUM
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
32
2.1.1
KONTROLLE
DES
MITOCHONDRIALEN
LYSATS
AUF
KONTAMINATIONEN
32
2.1.2
NACHWEIS
EINER
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET IN
DEN MITOCHONDRIEN
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
34
2.1.2.1
HELIKASE-ASSAY
MIT
RNA
I
35
2.1.2.2
HELIKASE-ASSAY
MIT
RNA
II
37
2.1.2.3
HELIKASE-ASSAY
MIT
DEM
DNA-SUBSTRAT
39
2.1.3
ABHAENGIGKEIT
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
HELIKASE
VON
COFAKTOREN
40
2.1.3.1
ABHAENGIGKEIT
DER
HELIKASE-AKTIVITAET
VON
ATP,
MAGNESIUM
UND
DER
INTEGRITAET
DER
MITOCHONDRIALEN
PROTEINE
40
2.1.3.2
SUBSTITUTION
VON
ATP
DURCH
ATP-DERIVATE
42
2.1.3.3
SUBSTITUTION
VON ATP
DURCH
ANDERE
NUKLEOSIDTRIPHOSPHATE
43
2.1.4
COLOKALISATION
VON
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
UND
RNA
EDITING-AKTIVITAET
44
2.1.4.1
RNA
EDITING-ASSAY
45
2.1.4.2
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
VON
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
46
2.1.4.3
FRATIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
AUF
EINEM
GLYCERIN-GRADIENTEN
48
2.2
IDENTIFIZIERUNG
PUTATIVER
RNA
HELIKASE-GENE
IM
GENOM
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
51
2.2.1
AMPLIFIZIERUNG VON
RNA
HELIKASE-FRAGMENTEN
MITTELS
PCR
MIT
DEGENERIERTEN
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
52
2.2.2
5-RACE
DES
RNA
HELIKASE-FRAGMENTS
"AM
30-33"
53
2.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
HELM
54
2.3.1
3'-RACE
UND
VOLLSTAENDIGE
AMPLIFIKATION
VON
HELM
55
2.3.2
GENOMORGANISATION
UND
EXPRESSION
VON
HELM
56
2.3.3
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
UND
FUNKTION
VON
HEL64
57
2.3.4
"KNOCK
OUT"
VON
HELM
60
2.3.4.1
KONSTRUKTE
ZUM
"KNOCK
OUT"
VON
HELM
61
2.3.4.2
TRANSFEKTION
VON
T.
BRUCEI
UND
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
62
2.4
CHARAKTERISIERUNG
VON
MHELOEL
66
2.4.1
3'-RACE
UND
VOLLSTAENDIGE
AMPLIFIKATION
VON
MHELAEL
66
2.4.2
GENOMORGANISATION
UND
EXPRESSION
VON
MHEL61
68
2.4.3
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
VON
MHEL61
70
2.4.4
"KNOCK
OUT"
VON
MHEL6L
71
2.5
MHELOEL,
MITOCHONDRIALE
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
UND
RNA
EDITING
73
2.5.1
COLOKALISATION
VON
MHEL61
UND
MITOCHONDRIALER
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
73
2.5.2
RNA
HELIKASE-ASSAY
MIT
EINER
MHELOEL-DEFIZIENTEN
T.
BRUCEI-ZIELLINIE
76
2.5.3
RNA
HELIKASE-ASSAY
MIT
MHEL61-DEPLETIERTEM
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
77
2.5.4
IN
VITRO
RNA
EDITING
IN
EINER
MHEL61-DEFIZIENTEN
T.
BRUCEI-ZELLINIE
B0
25,5
IN
VIVO
RNA
EDITING
IN
EINER
MHEL6L-DEFIZIENTEN
T.
BRUCEI-ZELLINIE
81
3
DISKUSSION
85
3.1
EINE
MITOCHONDRIALE
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
IN
TRYPANOSOMA
BRUCEI
UND
IHRE
MOEGLICHE
BETEILIGUNG
AM
RNA
EDITING
85
3.1.1
CHARAKTERISTIKA
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
85
3.1.2
RNA
EDITING-RELEVANTE
EIGENSCHAFTEN
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
88
3.1.3
ZUM
RNA
EDITING
ALTERNATIVE
FUNKTIONEN
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
92
3.1.4
DIE
BETEILIGUNG
EINER
RNA
HELIKASE
AM
RNA
EDITING
-
WARUM?
93
3.1.5
PERSPEKTIVEN
I
95
3.2
DIE
MITOCHONDRIALE
RNA
HELIKASE
MHEL61:
EINE
KOMPONENTE
DES
RNA
EDITING-APPARATS
98
3.2.1
GENOMORGANISATION,
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
VON
MHELOEL
98
3.2.2
BASIERT
DIE
MITOCHONDRIALE
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
AUF
MHELOEL
?
(I)
COLOKALISATIONSUNTERSUCHUNGEN
100
3.2.3
BASIERT
DIE
MITOCHONDRIALE
RNA
HELIKASE-AKTIVITAET
AUF
MHELOEL?
(H)
UNTERSUCHUNG
MHELOEL-DEPLETIERTER
MITOCHONDRIALER
LYSATE
101
3.2.4
RNA
EDITING
IN
EINER
MHELOEL-DEFIZIENTEN
ZELLINIE:
EDITING
IN
VITRO
VERSUS
EDITING
IN
VIVO
103
3.2.5
EFFIZIENTES
RNA
EDITING
ERFORDERT
DIE
BETEILIGUNG
VON
MHEL61
-
WESHALB?
105
3.2.6
PERSPEKTIVEN
II
107
3.3
FLUCHT
VOR
DEM
SELEKTIONSDRUCK
DURCH
NICHT-HOMOLOGE
REKOMBINATION:
DIE
RNA
HELIKASE
HEL64
IST
EIN
ESSENTIELLES
GEN
IN
TRYPANOSOMA
BRUCEI
109
3.3.1
GENOMORGANISATION,
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
VON
HEL64:
HINWEISE
AUF
DIE
FUNKTION?
109
3.3.2
INTEGRATION
VON
DNA
AN
"FALSCHER"
STELLE:
EIN
UNGEWOEHNLICHES
REKOMBINATIONSEREIGNIS
110
3.3.3
PERSPEKTIVEN
III
111
4
ZUSAMMENFASSUNG
113
5
MATERIALIEN
114
5.1
STAEMME
114
5.2
PLASMIDE
114
5.3
DNA-OLIGONUKLEOTIDE
116
5.4
GROESSENMARKER
118
5.5
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
118
5.6
CHEMIKALIEN
118
5.7
RADIONUKLEOTIDE
120
5.8
ENZYME
UND
ANDERE
PROTEINE
120
5.9
KITS
121
5.10
GERAETE
121
5.11
SONSTIGES
122
5.12
DATENVERARBEITUNG
123
6
METHODEN
124
6.1
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
124
6.1.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
124
6.1.2
MEDIEN
125
6.1.3
KULTUR
DER
PROZYKLISCHEN
FORM
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
127
6.1.4
KULTUR
DER
BLUTSTROM-FORM
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
128
6.1.5
KULTUR
VON
LEISHMANIA
TARENTOLAE
128
6.1.6
TRANSFEKTION
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
128
6.1.7
ISOLIERUNG
MITOCHONDRIALER
VESIKEL
AUS
TRYPANOSOMA
BRUCEI
129
6.1.8
ISOLIERUNG
VON
ZELLKERNEN
AUS
TRYPANOSOMA
BRUCEI
130
6.1.9
ANLEGEN
UND
LAGERUNG
VON
BAKTERIENKULTUREN
131
6.1.9.1
ANLEGEN
EINER
BAKTERIENKULTUR
131
6.1.9.2
LAGERUNG
EINER
BAKTERIENKULTUR
131
6.1.10
KOMPETENZINDUKTION
VON
ESCHERICHIA
COLI
ZELLEN
131
6.1.11
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
ZELLEN
132
6.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
133
6.2.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
133
6.2.2
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
135
6.2.3
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
135
6.2.4
DNA-ISOLIERUNG
AUS
TRYPANOSOMA BRUCEI
136
6.2.5
RNA-ISOLIERUNG
AUS
TRYPANOSOMA BRUCEI
136
6.2.6
PLASMID-ISOLIERUNG
AUS
ESCHERICHIA
COLI
137
6.2.7
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
137
6.2.8
RESTNKTIONSVERDAU
VON
DNA
137
6.2.9
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
138
6.2.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION,
PCR
138
6.2.10.1
PCR
MIT
GENOMISCHER
DNA
ODER
PLASMID-DNA
ALS
MATRIZE
139
6.2.10.2
RACE
("RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
"
)
139
6.2.10.3
KOLONIE-PCR
139
6.2.10.4
SYNTHESE
DIGOXIGENIN-MARKIERTER
PROBEN
140
6.2.11
DNA-SEQUENZIERUNG
140
6.2.12
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
140
6.2.12.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
141
6.2.12.2
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
141
6.2.12.3
NATIVE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
141
6.2.13
DETEKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
142
6.2.13.1
ETHIDIUMBROMID-FAERBUNG
142
6.2.13.2
TOLUIDINBLAU
O-FAERBUNG
142
6.2.13.3
"UV-SHADOWING"
142
6.2.13.4
AUTORADIOGRAPHIE
142
6.2.13.5
CHEMOLUMINISZENZ
143
6.2.14
GELREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UND
RNA
143
6.2.15
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
143
6.2.16
IN
VIRRO-TRANSKRIPTION
VON
RNA
MIT
POLYMERASEN
DER
PHAGEN
T3
UND
T7
143
6.2.17
PRAEPARATION
VON
DOPPELSTRAENGIGER
RNA
UND
DNA
144
6.2.18
5'-ENDMARKIERUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
144
6.2.19
3'-ENDMARKIERUNG
VON RNA
145
6.2.20
"RANDOM
PRIME"
MARKIERUNG
145
6.2.21
BESTIMMUNG
DER
EINBAURATE
UND
AUSBEUTEBERECHNUNG
BEI
RADIOAKTIVEN
MARKIERUNGEN
UND
TRANSKRIPTIONEN
145
6.2.22
SOUTHERN
BLOT
146
6.2.23
NORTHERN
BLOT
147
6.2.24
RNA
HELIKASE-ASSAY
147
6.2.25
RNA
EDITING-ASSAY
148
6.2.26
PRIMER
EXTENSION
148
6.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
150
63.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
150
6.3.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
151
6.3.2.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
151
63.2.2
MESSUNG
DER
ABSORPTION
BEI
280
NM
152
6.3.3
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
(D1SK-SDS-PAGE)
152
6.3.4
FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
152
6.3.4.1
COOMASSIE-FAERBUNG
152
6.3.4.2
SILBERFAERBUNG
153
6.3.5
TCA-FAELLUNG
VON
PROTEINEN
153
6.3.6
EINENGEN
VERDUENNTER
PROTEINLOESUNGEN
153
6.3.6.1
ULTRAFILTRATION
DURCH
ZENTRIFUGATION
153
6.3.6.2
ULTRAFILTRATION
IN
EINER
RUEHRZELLE
154
6.3.7
DIALYSE
154
6.3.8
PRAEPARATION
VON
GANZZELL-EXTRAKT
154
6.3.9
PRAEPARATION
VON
CYTOPLASMATISCHEM
SLOO-EXTRAKT
154
6.3.10
PRAEPARATION
VON
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
155
6.3.11
PRAEPARATION
VON
KEMLYSAT
155
6.3.12
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
HEL64.TR
UND
MHEL61.TR
155
6.3.12.1
EXPRESSION
156
6.3.12.2
AUFREINIGUNG
156
6.3.13
IMMUNISIERUNG
UND
GEWINNUNG
VON
ANTISERUM
156
6.3.14
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
AUS
ANTISERUM
157
6.3.14.1
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
A-HEL64-ANTIKOERPEM
UEBER
EINE
ANTIGENSAEULE
157
6.3.14.2
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
A-MHEL61-ANTIKOERPEM
UEBER
GEBLOTTETES
ANTIGEN
158
6.3.15
WESTERN
BLOT
158
6.3.16
FRAKTIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
MIT
AMMONIUMSULFAT
159
6.3.17
GLYCERIN-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
VON
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
160
6.3.18
IMMUNDEPLETION
VON
MITOCHONDRIALEM
LYSAT
160
7
LITERATURVERZEICHNIS
162
ANHANG
ABB.
A-L:
DNA-SEQUENZ
UND
PROTEINSEQUENZ
VON
HEL64
ABB.
A-2:
DNA-SEQUENZ
UND
PROTEINSEQUENZ
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