Spezifische Integration modifizierter Vimentin-cDNA in das Genom eukaryotischer Zellen und Untersuchungen zur Expression der Proteinmutanten:
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Datensatz im Suchindex
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.1. INTERMEDIAERFILAMENTE ALS TEIL DES ZYTOSKELETTS.1
1.2. KLASSIFIZIERUNG DERLFS.2
1.3. STRUKTUR DER EF-PROTEINE.3
1.4. AUFBAU DER 10 NM-FILAMENTE.5
1.5. WECHSELWIRKUNGEN DER IFS MIT ANDEREN ZELLSTRUKTUREN.7
1.6. MOEGLICHE FUNKTIONEN DER IFS.8
1.7. ZIELSETZUNG DER ARBEIT.9
1.8. DNA-REKOMBINATION.10
2.
MATERIAL UND METHODEN_ 13
2.1. MATERIAL. .VRR.13
2.1.1. CHEMIKALIEN.13
2.1.2 ENZYME UND PROTEINE.14
2.1.3. NUKLEOTIDE UND NUKLEINSAEUREN.14
2.1.3.1. RADIONUKLEOTIDE.14
2.1.3.2. DESOXYNUKLEOTIDE.15
2.1.3.3. DNA-GROESSENSTANDARDS.15
2.1.3.4. PLASMIDE.15
2.1.4. HAEUFIG VERWENDETE PUFFER, LOESUNGEN UND MEDIEN.16
2.1.4.1. ALLGEMEINE DNA- UND PROTEINPUFFER.16
2.1.4.2. MEDIEN UND LOESUNGEN FUER DIE BAKTERIENANZUCHT.17
2.1.4.3. MEDIEN UND LOESUNGEN FUER DIE EUKARYOTISCHE ZELLKULTUR.17
2.1.5. BAKTERIENSTAEMME.17
2.1.6. EUKARYOTISCHE ZELLINIEN.18
2.1.7. ANTIKOERPER.18
2.1.7.1. ERSTANTIKOERPER.18
2.1.7.2. ZWEITANTIKOEIPER.19
2.1.8. GERAETE UND SONSTIGE HILFSMITTEL.19
2.2. METHODEN.21
2.2.1. KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN.21
2.2.1.1. ALLGEMEINES.21
2.2.1.2. AUFTAUEN UND AUSSAAT VON SAEUGERZELLEN.21
2.2.1.3. KULTIVIERUNG UND TRANSFER VON SAEUGERZELLEN.21
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.4. ANLEGEN VON DAUERKULTUREN.
2.2.1.5. ZELLZAHLBESTIMMUNG.
2.2.1.6. BESTIMMUNG DER LEBENDEN ZELLEN DURCH TYPANBLAU-AUSSCHLUSS.
2.2.1.7. KLONIERUNG DURCH KONTROLLIERTE VERDUENNUNG ("LIMITING
DILUTION").
2.2.1.8. SELEKTION MIT DEM ANTIBIOTIKUM G418.
2.2.1.9. HERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEM MEDIUM.
2.2.1.10. INDUKTION MIT ZINK UND CADMIUM.
2.2.2. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.
2.2.2.1. ANLEGEN VON E.CO/I-DAUERKULTUREN.
2.2.2.2. E.CO/R-FLUESSIGKULTUREN.
2.2.2.3. HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN.
2.2.2.4. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT PLASMID-DNA.
2.2.2.5. BLAU/WEISS-SELEKTION.
2.2.3. PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN.
2.2.3.1.
MINIPRAEPARATION VON
PLASMID-DNA.
2.2.3.2. MAXIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.
2.2.3.3. ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN.
2.2.4. REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.
2.2.4.1. PHENOLEXTRAKTION.
2.2.4.2. ETHANOLFAELLUNG.
2.2.4.3. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.
2.2.4.4. ISOLIERUNG RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-FRAGMENTE.
2.2.4.5. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.
2.2.5. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON NUKLEINSAEUREN.
2.2.5.1. HYDROLYSE VON PLASMID-DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.
2.2.5.2. S'-DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID-DNA.
2.2.5.3.5'-TERMINALES AUFFUELLEN VON DNA-FRAGMENTEN.
2.2.5.4. LIGIERUNG VON DNA.
2.2.5.5. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA DURCH RANDOM-PRIME-LABELING.
2.2.6.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR).
2.2.7. DNA-SEQUENZIERUNG.
2.2.8. GELELEKTROPHORESEN.
2.2.8.1. NATIVE GELELEKTROPHORESE VON DNA IN AGAROSEGELEN.
2
.
2
.
82
.
PRAEPARATIVE GELELEKTROPHORESE VON DNA IN AGAROSEGELEN.
2.2.8.3. DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE VON DNA.
2.2.8.4. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN (SDS-PAGE)
2.2.8.5. COOMASSIE BRILLIANT BLUE-FAERBUNG VON PROTEINEN.
22
.22
.22
.23
.23
.24
.24
.24
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.24
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.25
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.28
.28
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.29
.29
.29
.30
.30
.30
.30
.31
.31
YY.31
.32
.32
.32
.33
.33
.34
.35
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.9. BLOT-VERFAHREN.35
2.2.9.1. SOUTHEM-BLOT.35
2.2.9.1.1. DNA-HYBRIDISIERANG.35
2.2.9.1.2. ENTFERNEN DER
32P-DNA-SONDEN.36
2.2.9.2. WESTEM-BLOT (IMMUNOHLOT).36
2.2.9.2.1. IMMUNREAKTION ZUM VIMENTIN-NACHWEIS.37
2.2.10. DURCHFLUSSZYTOMETRIE.38
2.2.10.1. ERNTE UND FIXIERUNG DER ZELLEN .38
2.2.10.2. VIMENTIN-MARIDENMG MIT ANTIKOERPERN.38
2.2.10.3. DNA-MARKIERUNG MIT PROPIDIUMJODID.39
2.2.11. INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE.39
2.2.11.1. FIXIERUNG DER ZELLEN.39
2.2.11.2. ANTIKOERPERBINDUNG.39
2.2.11.3. KEMMAIKIERUNG MIT PROPIDIUMJODID.40
2.2.11.4. MIKROSKOPIE.40
2.2.12. TRANSFEKTIONSMETHODEN.41
2.2.12.1. CALCIUMPHOSPHATMETHODE.41
2.2.12.2. MIKROINJEKTION.42
2.2.12.3. DNA-TRANSFER DURCH DAS "BIOLISTIC PARTICLE DELIVERY
SYSTEM".42
2.2.12.3.1. PRAEPARATION DER MICROCARRIER.44
2.2.12.3.2. ADSORPTION VON DNA AN MICROCARRIER.44
2.2.12.3.3. BESCHUSS DER ZELLEN.44
2.2.13. HISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON SS-GALAKTOSIDASE.45
2.2.14. BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET IM ZELLYSAT.45
2.2.15. BESTIMMUNG DER LUCIFERASE-AKTIVITAET IM ZELLYSAT.46
2.2.16. QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD.47
2.2.17. SYNTHESE DER OLIGONUKLEOTIDE.47
2.2.17.1. REINIGUNG DER OLIGONUKLEOTIDE.47
3.
ERGEBNISSE.48
3.1. KONSTRUKTION EINES VIMENTIN-EXPRESSIONSSYSTEMS.48
3.1.1. EINLEITUNG.48
3.1.2. DER PROMOTOR DES MENSCHLICHEN METALLOTHIONEIN-N
AGENS.49
3.1.2.1. UMKLONIERUNG DES M2.6-PROMOTORS IN PUC8.49
3.1.2.2. UMKLONIERUNG DES M2.6-PROMOTORS IN PBLUESCRIPT KS+.51
3.1.3. EINFUEGEN EINES SV40-POLYADENYLIERUNGSSIGNALS.51
3.1.4. ELIMINIERUNG VON RESTRIKTIONS-SCHNITTSTELLEN DER ENZYME SA/I UND
ECORI.51
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.5. EINFUEGEN DER VIMENTIN-CDNA.
3.2. KONSTRUKTION VON VEKTOREN ZUR STABILEN TRANSFEKTION VON
VIMENTIN-CDNA.
3.2.1. EINLEITUNG.
3.2.2. UMKLONIENMG DER VIMENTIN-EXPRESSIONSKASSETTE IN POG45.
3.2.2.1. AUSTAUSCH DES PROMOTORFRAGMENTES.
3.2.2.2. KONTROLLE DER FUNKTION DES EXPRESSIONSPLASMIDES NACH
TRANSIENTER TRANSFEKTION.
3.2.3. N-TERMINALE DELETIONSMUTANTE DES VIMENTINS.
3.2.4. UMKLONIERUNG IN DAS POG-VEKTORSYSTEM.
3.2.4.1. UMKLONIERUNG DER DELETION A32.
3.2.4.2. UMKLONIERUNG DER DELETIONEN A16/71 UND A26/66.
3.2.4.3. UMKLONIERUNG DER DELETIONEN A41/96, A45/96 UND A45/103.
3.2.5. SEQUENZIERUNG DER DELETIONSMUTANTEN.
3.3. TRANSIENTE EXPRESSION VON N-TERMINALEN DELETIONSMUTANTEN VON
VIMENTIN IN
EUKARYOTISCHEN ZELLEN.
3.3.1. TRANSIENTE EXPRESSION N-TERMINALER DELETIONSMUTANTEN IN
SW13-F8-ZELLEN
3.3.2. TRANSIENTE EXPRESSION N-TERMINALER DELETIONSMUTANTEN IN
MCF7-ZEUEEN.
3.3.3. TRASNIENTE EXPRESSION N-TERMINALER DELETIONSMUTANTEN IN
E25/B2-ZELLEN.
3.4. INTEGRATION EINES FRT IN DAS GENOM VON SW13-F8- UND MCF7-ZELLEN.
3.4.1. BESTIMMUNG DER SELEKTIONSBEDINGUNGEN FUER SW13-F8- UND
MCF7-ZELLEN.
53
.55
.55
.55
.55
.58
.59
.62
.62
.63
.63
.63
.64
.64
.66
.67
.70
.73
3.4.2. TRANSFEKTION VON SW13-F8-ZELLEN MIT PNEOSSGAL UND SELEKTION
G418-RESISTENTER
ZELLEN.
3.4.3. TRANSFEKTION VON MCF7-ZELLEN MIT PNEOSSGAL UND SELEKTION
G418-RESISTENTER
ZELLEN.
3.4.3.1. TRANSFEKTION NACH DER CALCIUMPHOSPHATMETHODE.
3.4.3.2. TRANSFEKTION MIT DEM "BIOLISTIC PARTICLE DELIVERY SYSTEM".
3
.
4
.
4
. NACHWEIS DER INTRAMOLEKULAREN REKOMBINATION ZWEIER GENOMISCHER FRTS
UND
KLONIERUNG SS-GALAKTOSIDASE-POSITIVER, G418-SENSITIVER ZELLINIEN.
3.4.5. BESTIMMUNG DER ANZAHL INTEGRIERTER PNEOSSGAL-VEKTOREN.
3.4.6. SEQUENZIERUNG DES GENOMISCHEN FRT IN DEN ZELLINIEN SW13SSGAL A2
UND MCF7SSGAL .
3.5. BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET DER FRT-TRAGENDEN
ZELLINIEN.
3.6. STABILE TRANSFEKTION VON MAUS-VIMENTIN UND SEINER N-TERMINALEN
DELETIONSMUTANTEN
IN .
3.7. EXPRESSION VON REKOMBINANTEM MAUS-VIMENTIN UND SEINER N-TERMINALEN
DELETIONSMUTANTEN IN ORT-SPEZIFISCH STABIL-TRANSFIZIERTEN E25/B2-ZELLEN.
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.1. EINFLUSS AUF DAS ENDOGENE VIMENTINNETZWERK.88
3.7.2. NACHWEIS DER EXPRESSION DES REKOMBINANTEN VIMENTINS IM
IMMUNOBLOT.90
3.7.2.1. EINFLUSS VON G418 AUF DIE EXPRESSION DES REKOMBINANTEN
VIMENTINS.93
3.7.3. CHARAKTERISIERUNG DER ZELLINIEN MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE.95
3.7.3.1. MESSUNG DER VIMENTINVERTEILUNG NACH 48 H-INDUKTION MIT ZN
27CD2+.95
3.7.3.2. ANALYSE DES ZELLZYKLUS.97
3.7.3.3. MESSUNG DER VIMENTINVERTEILUNG NACH LAENGEREN
INDUKTIONSZEITEN.100
3.7.3.4. MESSUNG DER VIMENTINVERTEILUNG NACH INDUKTION MIT VARIABLEN
ZN
27CD2+-KONZENTRATIONEN.101
3.7.3.5. VERGLEICH DER EXPRESSION DES MAUS-VIMENTINS UND VERSCHIEDENER
N-TERMINALER DELETIONSMUTANTEN.102
3.7.3.OE. MESSUNG DES ENDOGENEN VIMENTINS NACH INDUKTION
DER DELETIONSMUTANTE A45/103-.103
V
3.8. STABILE TRANSFEKTION VON MAUS-VIMENTIN UND SEINEN N-TERMINALEN
MUTANTEN IN VIMENTIN-FREIE MCF7SSGAL A2- UND MCF7SSGAL BL-ZELLEN.105
3.8.1. STABILE TRANSFEKTION DES MAUS-VIMENTIN-WILDTYPS.105
3.8.2. INDUKTION VON MAUS-VIMENTIN DURCH ZN
27CD2+ IN MCF7-ZELLEN.110
3.8.3. STABILE TRANSFEKTION DER N-TERMINALEN DELETIONSMUTANTEN AE26/66
UND A45/103 . 115
3.8.4. EXPRESSION DER MUTANTEN A26/66 UND A45/103 IN
STABIL-TRANSFIZIERTEN
MCF7-ZELLEN.118
4. DISKUSSION.120
4.1. TRANSIENTE EXPRESSION VON VIMENTIN-MUTANTEN.120
4.2. STABILE EXPRESSION DER VIMENTIN-MUTANTEN IN E25/B2-ZELLEN
NACH ORT-SPEZIFISCHER INTEGRATION.126
4.3. ORT-SPEZIFISCHE, INTRAMOLEKULARE REKOMBINATION IN VIMENTIN-FREIEN
ZELLINIEN.130
4.4. VERSUCH DER ORT-SPEZIFISCHEN INTEGRATION UND EXPRESSION VON
VIMENTIN
UND SEINER N-TERMINALEN MUTANTEN IN STABIL-TRANSFIZIERTEN
MCF7-ZELLEN.132
5. ZUSAMMENFASSUNG -.-----.-.136
6.
LITERATURVERZEICHNIS.-.-.-.-.---.-138
7. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.---.---.-151
8. ANHANG
154 |
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