Menschliche Immunglobulingene: Beiträge zur Struktur des menschlichen Kappa-Locus mit Hilfe der YAC-Klonierungstechnik
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
UND
PROBLEMSTELLUNG
.
1
ERGEBNISSE
.
4
2.
ISOLIERUNG,
CHARAKTERISIERUNG
UND
ZUORDNUNG
K-SPEZIFISCHER
YACS
.
6
2.1
SIND
BEIDE
KOPIEN
DES
K
-L
OCUS
IN
DEN
DNAS,
AUS
DENEN
DIE
YAC-KLON
BANKEN
KONSTRUIERT
WURDEN,
ENTHALTEN
?
.
6
2.2
AUSWAHL
DER
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
UND
TEST
AUF
GENOMISCHER
DNA
ODER
COSMIDEN
DES
K
-L
OCUS
.
8
2.3
PCR-ANALYSE
DER
YAC-KLONBANK
MARK
I
DES
CENTRE
D
'
ETUDE
DU
POLYMOR
PHISME
HUMAIN
(CEPH)
IN
PARIS
.
11
2.3.1
OPTIMIERUNG
DER
REAKTIONSBEDINGUNGEN
FUER
DIE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
12
2.3.2
PCR-ANALYSE
MIT
V
K
I-,
V
K
II-,
C
K
-
UND
M21
7-1
-SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.13
2.3.3
PCR-ANALYSE
MIT
M138-13-SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
15
2.4
PCR-ANALYSE
DER
YAC-KLONBANK
DES
CENTER
FOR
GENETICS
IN
MEDICINE
(CGM)
DER
WASHINGTON
UNIVERSITY
IN
SLLOUIS
.
15
2.4.1
IDENTIFIZIERUNG
POSITIVER
VK-HYBRIDISIERUNGSSIGNALE
AUF
MEMBRANFILTERN
.
16
2.4.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
M1
38-13
HYBRIDISIERUNGSSIGNALEN
AUF
MEMBRANFIITEM
.
17
2.5
ISOLIERUNG
UND
VERIFIZIERUNG
DER
YAC-KLONE
.
18
2.5.1
YAC-KLONE,
DIE
AUS
DER
CEPH-BANK
ISOLIERT
WURDEN
.
19
2.5.2
YAC-KLONE,
DIE
AUS
DER
CGM-BANK
ISOLIERT
WURDEN
.
19
2.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
YACS
.
21
2.6.1
GROESSENBESTIMMUNG
DER
YACS
DURCH
PFGE-ANALYSEN
.
21
2.6.2
SOUTHEMBLOT-ANALYSEN
UND
ZUORDNUNG
DER
YACS
.
22
2.6.2.1 YACS,
DIE
DIE
W-REGION
ENTHALTEN
.
24
2.6.2.2
YACS,
DIE
ORPHONGENE
VON
CHR.22
ABDECKEN
.
27
2.6.2.3
YACS
MIT
Z-ORPHONGENEN
.
30
2.6.2.4
YACS,
DIE
DAS
GEN
V268
UEBERDECKEN
.
32
2.6.2.5
YACS,
DIE
TEILE
DER
PROXIMALEN
KOPIE
DES
K
-L
OCUS
ENTHALTEN
.
33
2.6.2.6
YACS,
DIE
TEILE
DER
DISTALEN
KOPIE
DES
MENSCHLICHEN
K
-L
OCUS
ENTHALTEN
.
43
2.6.2.7
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
EINIGEN
YACS,
DIE
TEILE
DER
DISTALEN
KOPIE
ODER
DAS
ORPHONGEN
V268
ENTHALTEN
.
47
2.6.2.8
YACS,
DIE
NICHT
EINDEUTIG
ZUGEORDNET
WERDEN
KONNTEN
.
47
2.6.2.9
ZUSATZBANDEN
ERWIESEN
SICH
ALS
KREUZHYBRIDISIERUNGEN
MIT
ANDEREN
V
K
-
GENEN
.
48
2.6.2.10
EINIGE
BEREICHE
DES
K
-L
OCUS
SIND
IN
YAC-KLONBANKEN
UNTERREPRAESENTIERT
.
52
3.
1
BEITRAEGE
ZUR
AUFKLAERUNG
DER
STRUKTUR
DES
MENSCHLICHEN
K
-L
OCUS
.
54
3.1
YACS,
DIE
DIE
PROXIMALE
KOPIE
ENTHALTEN,
DECKEN
DIE
LUECKEN
ZWISCHEN
DEN
GENEN
A30
UND
L1
,
SOWIE
L3
UND
L4
AB
.
54
3.2
KANN
DIE
STRUKTUR
DER
BEREICHE
DES
MENSCHLICHEN
K
-L
OCUS
,
DIE
IN
YACS
VERTRETEN
WAREN,
BESTAETIGT
WERDEN?
.
57
3.3
BEITRAEGE
ZUR
STRUKTUR
DER
DISTALEN
L-REGION
UND
EXTENSION
DER
DISTALEN
3'-L
REGION
.
58
3.3.1
DURCH
DAS
COSMID
COS32C6-2
DER
COSMIDSUBBANK
VON
32C6
KONNTE
DER
BEREICH
ZWISCHEN
DEN
GENEN
L24
UND
L25
ABGEDECKT
WERDEN
UND
DER
AB
SCHNITT
ZWISCHEN
XDAF
UND
L25
FEINKARTIERT
WERDEN
.
58
3.3.2
KANN
DIE
ZUORDNUNG
VON
COS1
38
ZUR
DISTALEN
L-REGION
BESTAETIGT
WERDEN?
.
60
3.3.3
DIE
DISTALE
L-REGION
KONNTE
DURCH
DAS
COSMID
COS
32C6-6
UM
11.5
KB
EX
TENDIERT
WERDEN
.
62
3.3.4
IDENTIFIZIERUNG
EINES
ZUSAETZLICHEN
VD-GENS
3
'
VON
L25
.
63
3.3.4.1
DIEZO-REGION
.
64
3.3.4.2
SEQUENZIERUNG
VON
ZO
UND
SEQUENZANALYSE
.
66
3.3.4.3
DIE
SEQUENZ
VON
ZO
IST
ZU
ORPHONGENSEQUENZEN
HOCH
HOMOLOG
.
69
3.3.4.4
DIE
ORPHONSONDE
M218-22
HYBRIDISIERT
MIT
32C6,
YWHZ30
UND
YWHZ31
.
72
3.3.4.5
VERSUCHE
ZUR
KONSTRUKTION
EINER
SINGULAEREN
HYBRIDISIERUNGSPROBE
AUS
DER
FLANKE
VON
ZO.
72
3.3.4.6
PFGE-UNTERSUCHUNGEN
DER
YAC-KLONE
ZUR
ERMITTLUNG
DER
ENTFERNUNG
VON
ZO
ZUR
L25-REGION
.
73
3.3.4.7
LOKALISIERUNG
VON
ZO
IN
GENOMISCHER
DNA
DURCH
PFGE-UNTERSUCHUNGEN
.
75
3.4
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN
DES
5
'
-ENDES
DER
DISTALEN
O-REGION
.
77
4.
DISKUSSION
.
81
4.1
SCHWIERIGKEITEN
BEI
DER
KLONIERUNG
DES
K
-L
OCUS
DURCH
YACS
.
81
4.1.1
UNVOLLSTAENDIGE
IDENTIFIZIERUNG
K-SPEZIFISCHER
YACS
IN
DER
MARKL-YAC-BANK
DESCEPH
.
81
4.1.2
UNVOLLSTAENDIGE
IDENTIFIZIERUNG
K-SPEZIFISCHER
YACS
IN
DER
CGM-YAC-BANK.82
4.1.3
MOEGLICHE
MECHANISMEN,
DIE
ZUM
AUFTRETEN
VON
CHIMAEREN
YACS
FUEHREN
KOENNEN
.
83
4.1.4
KLONIERBARKEIT
DES
HUMANEN
K
-L
OCUS
IN
YACS
.
85
4.1.5
AUFTRETEN
VON
MEHREREN
YACS
IN
YAC-KLONEN
.
86
4.2
DIE
ZUORDNUNG
DER
YACS
AUFGRUND
VON
DUPLIKATIONSDIFFERENZIERENDEN
POLYMORPHISMEN
IST NICHT UNPROBLEMATISCH
.
87
4.3
DIE
STRUKTUR
EINIGER
BEREICHE
DES
K
-L
OCUS
KANN,
SOFERN
SIE
AUF
YACS
VERTRETEN
WAREN
,
BESTAETIGT
WERDEN
.
88
4.4
EINIGE
BEREICHE
DES
K
-L
OCUS
BEREITEN
BEI
DER
KLONIERUNG
IN
PROKARYON
TISCHEN
SYSTEMEN
PROBLEME
.
89
4.5
GELINGT
DIE
ZUORDNUNG
VON
COS
217
ZU
EINER
KOPIE
DURCH
VERGLEICH
MIT
COSMIDEN
AUS
32C6
?
.
90
4.6
ASPEKTE
ZUR
EVOLUTION
DER
ZO-REGION
.
92
5.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
96
5.1
CHEMIKALIEN UND
ENZYME
.
96
5.2
BAKTERIENSTAEMME,
VEKTOREN,
DNA,
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
98
5.3
ZELLKULTUR
.
99
5.4
ABSUCHEN VON
YAC-KLONBANKEN
.
99
ABSUCHEN
DER
MARKL-YAC-KLONBANK
DES
CEPH
.
99
ABSUCHEN
DER
CGM-1-YAC-KLONBANK
.
99
5.5
HERSTELLUNG VON
COSMIDSUBBANKEN
AUS
YAC-KLONEN
.
100
5.6
ABSUCHEN VON
COSMIDSUBBANKEN
.
101
5.7
PRAEPARATION
VON
DNA
AUS
PC-3
.
102
5.8
PRAEPARATION
VON
DNA
AUS
YAC-KLONEN
.
102
5.9
PRAEPARATION
VON
DNA
AUS
COSMID
BZW.
PLASMIDKLONEN
.
103
5.10
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
103
5.11
SPALTUNG
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSNUKLEASEN
.
104
5.12
GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
105
KONVENTIONELLE
GELELEKTROPHORESE
.
105
PULSFELDGELELEKTROPHORESE
(PFGE)
.
105
5.13
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
PLASMIDVEKTOREN
.
106
5.14
DNA-TRANSFER
AUF
NYLONMEMBRANEN
UND
PAPIERFILTER
.106
5.15
HERSTELLUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDEN
UND
HYBRIDISIERUNG
.
106
5.16
DNA-SEQUENZIERUNG
.107
5.17
BIOLOGISCHE
SICHERHEIT
.
108
5.18
COMPUTERPROGRAMME
.
108
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
109
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.112
8.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
121
LEBENSLAUF
.
123 |
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