Beiträge zur Charakterisierung einer Glutamylaminopeptidase aus Acinetobacter calcoaceticus (E.C.3.4.11.7.):
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. EINLEITUNG 6
THEORETISCHER TEIL
2. ALLGEMEINE GRUNDLAGEN 8
2.1 ALLGEMEINE BAKTERIOLOGIE 8
2.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER BAKTERIENZELLE 8
2.1.2 DIE ZELLWAND 9
2.1.3 DIE BIOLOGISCHEN MEMBRANEN BEI BAKTERIEN 10
2.2 DER BAKTERIENSTAMM
ACINETOBACTER CALCOACETICUS 11
2.3 OPTIMIERUNG DER WACHSTUMSBEDINGUNGEN 12
2.4 PROTEASEN 13
2.5 PROTEASEN MIT SPEZIFITAET FUER N-TERMINALE DICARBONSAEUREN 14
2.6 ANGIOTENSINASEN 17
3. GEWINNUNG VON MEMBRANGEBUNDENEN ENZYMEN 20
3.1 ZELLAUFSCHLUSS 20
3.2 SOLUBILISIERUNG MEMBRANGEBUNDENER ENZYME 21
3.3 BEISPIELE UND LOKALISATION MEMBRANGEBUNDENER ENZYME 22
AUS
ACINETOBACTER CALCOACETICUS
4. REINIGUNG VON ENZYMEN AUS SOLUBILISATEN 26
4.1 GRUNDLAGEN DER WICHTIGSTEN REINIGUNGSVERFAHREN 26
4.2 ELEKTROPHORESE 27
PRAKTISCHER TEIL
5. PRAKTISCHE DURCHFUEHRUNG 29
5.1 CHEMIKALIEN 29
5.2 METHODEN 34
5.2.1 REINIGUNGSVERFAHREN 34
5.2.2 POLYACRYLAMIDELEKTROPHORESE 34
5.2.3 PROTEINBESTIMMUNG - LOWRY 35
5.2.4 KATALYTISCHE PARAMETER DES ENZYMS 35
5.2.5 NUTZUNG SPEKTRALPHOTOMETRISCHER METHODEN 37
5.2.6 FLUORIMETRIE 37
5.2.7 HEMMUNG DES ENZYMS 38
5.2.8 HERSTELLUNG VON PROENZYM 40
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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SEITE
6. REINIGUNG DER EAP AUS
ACINETOBACTER CALCOACETICUS 41
6.1 ZUECHTUNG, ERNTE, ZELLAUFSCHLUSS, SOLUBILISIERUNG UND ERSTE 41
REINIGUNGSSCHRITTE
6.2 FPLC 42
7. CHARAKTERISIERUNG DER EAP 47
7.1 OPTIMIERUNG DER MESSBEDINGUNGEN 47
7.1.1 PH-WERT * 47
7.1.2 TEMPERATUR 48
7.1.3 EINFLUSS DER KONZENTRATION VERSCHIEDENER DETERGENTIEN 50
7.1.4 EINFLUSS DER ENZYMKONZENTRATION 52
7.1.5 EINFLUSS DER SUBSTRATKONZENTRATION - 53
BESTIMMUNG KINETISCHER PARAMETER DER EAP
7.2 SUBSTRATSPEZIFITAET DER EAP - 55
7.3 AKTIVATOREN DER EAP 58
7.4 EINFLUSS VON INHIBITOREN AUF DIE EAP 60
7.4.1 KLASSIFIZIERUNG DER EAP DURCH GRUPPENSPEZIFISCHE INHIBITOREN 60
7.4.2 EINFLUSS VERSCHIEDENER IONEN AUF DIE ENZYMAKTIVITAET DER EAP 66
7.4.3 EINFLUSS VON AMINOSAEUREN AUF DIE AKTIVITAET DER EAP 68
7.4.4 EINFLUSS VON ANTIBIOTIKA UND BIOLOGISCH AKTIVEN PEPTIDEN AUF DIE
EAP 69
7.5 PRODUKTHEMMUNG 73
7.6 REAKTION DER EAP MIT PHOSPHATEN 75
7.7 REAKTION DER EAP MIT SH-REAGENTIEN 76
8. CHARAKTERISIERUNG DES AKTIVEN ZENTRUMS DER EAP 77
8.1 REAKTIVIERUNG DER EAP NACH HEMMUNG MIT EDTA UND D-PA 77
8.2 WEITERE CHARAKTERISIERUNG DER AMINOSAEUREN 80
IM AKTIVEN ZENTRUM DER EAP
8.2.1 KINETISCHE EXPERIMENTE 80
8.2.2 BESTIMMUNG ESSENTIELLER AMINOSAEUREN DURCH CHEMISCHE 83
MODIFIZIERUNG UND KOVALENTE MARKIERUNG
9. DISKUSSION 89
9.1 MODELL DES AKTIVEN ZENTRUMS DER EAP 98
9.2 MODELL DES REAKTIONSVERLAUFES DER EAP MIT L-GLU-PNA 100
10. LITERATURVERZEICHNIS 102 |
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