Die Initiation der Transkription in den Mitochondrien höherer Pflanzen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1996
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DIE INITIATION DER TRANSKRIPTION IN DEN
MITOCHONDRIEN HOEHERER PFLANZEN
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES GRADES
EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
AM FACHBEREICH CHEMIE DER FREIEN UNIVERSITAET BERLIN
VORGELEGT VON
FRANK HATZACK
AUS BERLIN
1996
IMAGE 2
INHALT
1. EINLEITUNG 1
1.1. DER EVOLUTIONAERE URSPRUNG VON MITOCHONDRIEN UND CHLOROPLASTEN 1
1.2. GROESSE UND ORGANISATION MITOCHONDRIALER GENOME 1
1.3. GRUNDZUEGE DER TRANSKRIPTION IN DEN MITOCHONDRIEN VON VERTEBRATEN 3
1.4. MITOCHONDRIALE PROMOTORSTRUKTUREN UND TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IN
VERTEBRATEN 4
1.5. MEHRERE PROMOTOREN IM MITOCHONDRIALEN GENOM VON SACCHAROMYCES
CEREVISIAE 7
1.6. SPEZIFISCHE INITIATION IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE: SC-MTTFB
FUNGIERT ANALOG ZU EUBAKTERIELLEN O-FAKTOREN 8
1.7. SC-MTTFA HAT EINE *HISTON-AEHNLICHE FUNKTION IN SACCHAROMYCES
CEREVISIAE 8
1.8. KONSERVIERTE SEQUENZMOTIVE UMGEBEN TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTE IN
MITOCHONDRIALEN GENOMEN HOEHERER PFLANZEN 9
1.9. ZIELE DER ARBEIT 12
2. MATERIAL 13
2.1. VERSUCHSPFLANZEN 13
2.2. BAKTERIENSTAMM 13
2.3. FEINCHEMIKALIEN 13
2.4. RADIOCHEMIKALIEN 14
2.5. DNA-MODIFIZIERENDE ENZYME 14
2.6. NUKLEINSAEUREN 14
2.7. KITS 16
2.8. AUTORADIOGRAFIE 16
2.9. ELEKTROPHORESEKAMMERN 17
2.10. CHROMATOGRAPHIE UND ULTRAFILTRATION 17
2.11. GERAETE 17
2.12. PUFFER UND LOESUNGEN 17
IMAGE 3
3. METHODEN 20
3.1. STANDARDMETHODEN 20
3.2. ERZEUGUNG VON DELETIONSKLONEN MIT HILFE DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION 20
3.3. PRAEPARATION RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-PROBEN 20
3.4. ISOLIERUNG VON MITOCHONDRIEN AUS ERBSENSPROSSEN 23
3.5. AUFREINIGUNG EINES TRANSKRIPTIONSAKTIVEN PROTEINLYSATS AUS
ERBSENMITOCHONDRIEN 24
3.5.1. SOLUBILISIERUNG VON MITOCHONDRIEN 24
3.5.2. AMMONIUMSULFATFRAKTIONIERUNG 25
3.5.3. ANIONEN-AUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AUF DER MONOQ-SAEULE 26
3.6. IN VITRO TRANSKRIPTIONSTEST 27
3.7. ISOLIERUNG RADIOAKTIV MARKIERTER NUKLEINSAEUREN AUS
POLYACRYLAMIDGELEN 28
3.8. PRIMER-EXTENSION-ANALYSE 28
3.9. AUFREINIGUNG DNA-BINDENDER PROTEINE AUS ERBSENMITOCHONDRIEN UNTER
DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN 29
3.9.1. DENATURIERENDE LYSE VON MITOCHONDRIEN 29
3.9.2. CHROMATOGRAPHIE AN HYDROXYLAPATIT 30
3.9.3. RENATURIERUNG VON PROTEINEN DURCH TRITON X-100 30
3.9.4. KATIONEN-AUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AUF PHOSPHOCELLULOSE 31 3.9.5.
REVERSED-PHASE-HPLC 32
3.10. METHODEN ZUM NACHWEIS VON DNA-PROTEIN-INTERAKTION 32 3.10.1.
MOBIUETY-SHIFT-ANALYSE 32
3.10.2. UV-CROSSLINK-ANALYSE 33
3.11. BESTIMMUNG RELATIVER BINDUNGSAFFINITAETEN 34
3.12. QUANTIFIZIERUNG VON DNA-BINDUNGSAKTIVITAET 36
3.13. GROESSENBESTIMMUNG DNA-BINDENDER PROTEINE DURCH GELDISSEKTION 36
3.14. DETEKTION RADIOAKTIVER SIGNALE DURCH PHOSPHOIMAGE-ANALYSE 37
IMAGE 4
4. ERGEBNISSE 39
4.1. EIN IN VITRO TRANSKRIPTIONSSYSTEM FUER MITOCHONDRIEN DIKOTYLEDONER
PFLANZEN.... 39 4.1.1. AUSWAHL DER DNA-TEMPLATES UND DES GEEIGNETEN
PFLANZENMATERIALS 39 4.1.2. ISOLIERUNG EINES TRANSKRIPTIONSAKTIVEN
PROTEINEXTRAKTS AUS ERBSENMITOCHONDRIEN 40
4.1.3. DETEKTION DER SPEZIFISCHEN TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET 41
4.2. DIE TRANSKRIPTION DES ATP9 GENS AUS ERBSE WIRD IN VITRO AM
NONANUKLEOTIDMOTIV INITIIERT 45
4.3. SPEZIFISCHE INITIATION DER TRANSKRIPTION AN HETEROLOGEN PROMOTOREN
46 4.3.1. PROMOTOREN AUS SOJABOHNE 47
4.3.2. PROMOTOREN AUS OENOTHERA BERTERIANA 49
4.4. IN VITRO TRANSKRIPTION EINES TRNA PROMOTORS 51
4.5. FEINKARTIERUNG VON IN VITRO TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTEN 52
4.6. DELETIONSANALYSE DES ATP9 PROMOTORS AUS ERBSE 54
4.7. ENTWICKLUNG EINER AUFREINIGUNGSSTRATEGIE FUER DNA-BINDENDE PROTEINE
AUS ERBSENMITOCHONDRIEN 57
4.7.1. OPTION FUER EIN VERFAHREN UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN 58
4.7.2. DIE AUFREINIGUNGSMETHODE UMFASST DREI CHROMATOGRAPHISCHE SCHRITTE
59 4.7.3. DETEKTION VON DNA-BINDUNGSAKTIVITAET 61
4.8. IDENTIFIZIERUNG DNA-BINDENDER PROTEINE 63
4.8.1. DAS 44 KDA PROTEIN 64
4.8.2. DAS 32 KDA PROTEIN 66
4.9. DIE AUFREINIGUNGSEFFIZIENZ DER ENTWICKELTEN METHODE 68
4.10. PROMOTORSPEZIFISCHE DNA-BINDUNG 69
4.11. PROTEINBINDUNG IN VERSCHIEDENEN ABSCHNITTEN ZWEIER HETEROLOGER
PROMOTORREGIONEN 72
4.11.1 DIEARP9 PROMOTORREGION AUS ERBSE 72
4.11.2. DIE AFP 1 PROMOTORREGION AUS OENOTHERA 76
IMAGE 5
4.12. KONSERVIERTE SEQUENZELEMENTE SIND ENTSCHEIDEND FUER DIE BINDUNG DES
32 KDA PROTEINS 79
4.13. DAS 32 KDA UND DAS 44 KDA PROTEIN SIND IN TRANSKRIPTIONSAKTIVEN
PROTEINFRAKTIONEN ENTHALTEN 81
4.14. DIE ZUGABE BEIDER PROTEINE FUEHRT ZU EINER ERHOEHTEN TRANSKRIPTMENGE
IN VITRO... 84
5. DISKUSSION 87
5.1. INITIATION DER TRANSKRIPTION IN VITRO: DIE FUNKTION DES
NONANUKLEOTIDMOTIVS WIRD BESTAETIGT 87
5.2. ANDERE PROMOTORTYPEN IN DEN MITOCHONDRIALEN GENOMEN VON PFLANZEN?
87
5.3. DIE MINIMALEN PROMOTORREGIONEN VON ATP9 AUS ERBSE UND ATP AUS MAIS
HABEN EINEN AEHNLICHEN AUFBAU 89
5.4. BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN VON DNA-BINDUNGSPROTEINEN AUS ERBSE IM
VERGLEICH ZU DENEN VON MTTFA-PROTEINEN 90
5.5. ZWEI BENACHBARTE PROTEINBINDUNGSSTELLEN IN DEN PROMOTORREGIONEN VON
ATP9 AUS ERBSE UND ATPL AUS OENOTHERA 91
5.6. ERHOEHTE TRANSKRIPTMENGEN ALS INDIZ FUER EINE STIMULATION DER
TRANSKRIPTIONSINITIATION 94
5.7. UNTERSCHIEDLICHE DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN WEISEN AUF VERSCHIEDENE
FUNKTIONEN DER IDENTIFIZIERTEN PROTEINE HIN 95
5.8. EIN MFLHS-AEHNLICHES PROTEIN IN MITOCHONDRIEN HOEHERER PFLANZEN? 96
5.9. DIE TRANSKRIPTIONSINITIATION IN DEN MITOCHONDRIEN VON PFLANZEN,
VERTEBRATEN UND SACCHAROMYCES CEREVISIAE: GEMEINSAMKEITEN UND
UNTERSCHIEDE 97
6. ZUSAMMENFASSUNG .
7. LITERATUR 100
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