Untersuchungen zur biologischen Sicherheit gentechnisch modifizierter Starterorganismen am Beispiel von Lactobacillus curvatus und L. sake Stämmen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
1.
GENTECHNIK
UND
LEBENSMITTEL
1
2.
GENTECHNIK
UND
MIKROORGANISMEN
2
3.
SICHERHEITSBEWERTUNG
GENTECHNISCH
VERAENDERTER
MIKROORGANISMEN
4
4.
ASPEKTE
DER
SICHERHEITSBEWERTUNG
5
5.
"FOOD
GRADE"-SYSTEME
6
5.1.
EXTRACHROMOSOMALE
"FOOD
GRADE"-SYSTEME
7
5.2.
"FOOD
GRADE"-INTEGARTIONSSYSTEME
8
6.
NATUERLICHE
GENTRANSFERSYSTEME
10
6.1.
TRANSFORMATION
10
6.2.
TRANSDUKTION
11
6.3.
KONJUGATION
11
6.4.
TRANSPOSITION
12
7.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
14
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
16
1.
MIKROORGANISMEN
UND
PLASMIDE
16
2.
KULTURMEDIEN
19
3.
ANTIBIOTIKA
21
4.
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
21
5.
NACHWEIS
VON
ENZYMAKTIVITAET
21
6.
THERMOSENSITIVITAETSTEST
22
7.
DNS-ISOLIERUNG
AUS
LAKTOBAZILLEN
UND
LAKTOKOKKEN
22
7.1.
DNS-ISOLIERUNG
NACH
MARMUR
22
7.2.
GESAMT-DNS-ISOLIERUNG
24
7.3
PLASMID-DNS-ISOLIERUNG
25
8.
PLASMID-DNS-ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
MIT
QIAGENS-SAEULEN
26
9.
DNS-ISOLIERUNG
AUS
ESCHERICHIA
COLI
27
9.1.
ALKALISCHE
EXTRAKTION
VON
PLASMID-DNS
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
27
9.1.1.
CAESIUMCHLORID-DICHTEZENTRIFUGATION
28
9.2.
SCHNELLISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNS
29
9.2.1.
SCHNELLMETHODE
1
29
9.2.2.
SCHNELLMETHODE
2
30
10.
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
BACILLUS SUBTILIS
30
11.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER
DNS
31
II
INHALTSVERZEICHNIS
11.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
MIT
DEM
PHOTOMETER
31
11.2.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DURCH
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
32
12.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
32
13.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
33
14.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNS-MOLEKUELEN
33
14.1.
SPALTUNG
VON
DNS
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
33
14.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
34
14.3.
VERKNUEPFUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
T4-DNS-LIGASE
34
14.4.
KLENOW-BEHANDLUNG
VON
DNS-ENDEN
35
14.5.
T4-POLYMERASE-BEHANDLUNG
VON
DNS-ENDEN
36
14.6.
VERKUERZUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
DURCH
EXONUKLEASE
III
UND
HERSTELLUNG
VON
EXOKLONEN
37
15.
TRANSFORMATION
VON
ESCHNCHIA
COH:
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
MITTELS
CACLJ
38
15.1.
DURCHFUEHRUNG
DER
TRANSFORMATION
39
16.
ELEKTROPORATION
39
16.1.
ELEKTROPORATION
VON
E.
COH
40
16.1.1.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
40
16.1.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPORATION
VON
E.
COLI
40
16.2.
ELEKTROPORATION
VON
LAKTOBAZILLEN
41
16.2.1.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
41
16.2.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPORATION
41
16.3.
ELEKTROPORATION
VON
LACTOBACILLUS
CURVATUS
UND
L.
SAKE
42
16.3.1.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
42
16.3.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPORATION
42
16.4.
ELEKTROPORATION
VON
LACTOBACILLUS
CASEI
LK1
43
16.4.1.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
43
16.4.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPORATION
43
16.5.
ELEKTROPORATION
VON
LAKTOKOKKEN
44
16.5.1.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
44
16.5.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPORATION
44
17.
PROTOPLASTEN-TRANSFORMATION
VON
BACILLUS
SUBTILIS
45
17.1.
HERSTELLUNG
VON
PROTOPLASTEN
46
17.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
PROTOPLASTEN-TRANSFORMATION
46
18.
IN
VITRO
AMPLFIKATION
MIT
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
46
18.1.
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
47
19.
IMMOBILISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
MEMBRANFIITEM
48
19.1.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
MEMBRANFILTER
MITTELS
SOUTHERN
BLOT
48
19.2.
IMMOBILISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
BEI
DER
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
49
20.
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
NUKLEINSAEURESONDEN
49
INHALTSVERZEICHNIS
III
20.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
49
20.1.1.
HYBRIDISIERUNG
50
20.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
POLYNUKLEOTIDSONDEN
51
20.2.1.
HYBRIDISIERUNG
51
20.3.
AUTORADIOGRAPHIE
52
21.
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN
MARKIERTEN
NUKLEINSAEURESONDEN
52
21.1.
MARKIERUNG
VON
POLYNUKLEOTIDSONDEN
MIT
DIGOXIGENIN
52
21.2.
HYBRIDISIERUNG
53
21.3.
CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS
53
22.
SEQUENZANALYSE
VON
DNS-MOLEKUELEN
53
22.1.
SEQUENZIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNS
53
22.2.
DIREKTE
SEQUENZIERUNG
IN
VITRO
AMPLIFIZIERTER
DNS
54
22.3.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE,
DETEKTION
UND
AUSWERTUNG
55
III.
ERGEBNISSE
56
TEIL
A:
KONSTRUKTION
VON
"FOOD
GRADE"-INTEGRATIONSSYSTEMEN
UND
"FOOD
GRADE"
VEKTOREN
56
1.
DAS
KONDITIONELL
REPLIZIERENDE
PLASMID
PG
+
HOST5
ALS
INTEGRATIONSVEKTOR
56
1.1.
UNTERSUCHUNG
DER
HOMOLOGIE
ZWISCHEN
DEM
THERMOSENSITIVEN
INTEGRATIONSVEKTOR
PG
+
HOST5
UND
L.
SAKE
STAEMMEN
56
1.2.
UMKLONIERUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASEGENE
AUS
PMOB
1000
IN
PG
+
HOST5
57
1.2.1.
KLONIERUNG
DES
4,3
KB
HMDLLL-KPML-FRAGMENTS
VON
PMOBLOOO
IN
ESCHERICHIA
COLI
STAEMMEN
57
1.2.2.
KLONIERUNG
DES
4,3
KB
FFMDLLL-KPNI-FRAGMENTS
VON
PMOB
1000
IN
LACTOBACILLUS
CASEI
LK1
UND
BACILLUS
SUBTIHS
1012
57
1.2.3.
UMKLONIERUNG
DES
KATALASEGENS
AUS
PHKL
150
IN
PG
+
HOST5
58
1.2.4.
KLONIERUNG
DES
5,4
KB
HIWDLLL-FTTL-FRAGMENTS
VON
PMOB
1000
IN
.
CO//NM554
58
1.3.
ELEKTROPORATION
VON
L.
SAKE
STAEMMEN
MIT
PG
+
HOST5
UND
PGBLOO
59
1.4.
THERMOSENSITIVITAETSSTUDIEN
61
1.4.1.
UNTERSUCHUNG
DES
THERMOSENSITIVEN
CHARAKTERS
VON
PG
+
HOST5
IN
L.
SAKE
61
1.4.2.
UNTERSUCHUNG
ZUR
MOEGLICHEN
REVERSION
DES
THERMOSENSITIVEN
CHARAKTERS
VON
PGTIOST5
62
2.
DER
NICHT
REPLIKATIVE
VEKTOR
PORI
19
ALS
INTEGRATIONSVEKTOR
63
2.1.
UNTERSUCHUNG
ZUR
REPLIKATIONSFAEHIGKEIT
DES
"SUIZID"-VEKTORS
PORI19
63
2.2.
KONSTRUKTION
DER
INTEGRATIONSPLASMIDE
POBLOO
UND
POBCLOO
64
2.3.
INTEGRATION
DES
PLASMIDS
POBC
IN
STAEMME
VON
L.
SAKE
66
3.
DIE
SS-GALAKTOSIDASE
ALS
"FOOD-GRADE"-MARKER
66
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.
KOMPLEMENTATION
DES
LAC'
PHAENOTYPS
VON
L.
CURVATUS
LTH1432
66
3.2.
UTNKLONIERUNG
DES
5,4
KB
HZ'NDLLL/PSTL-FRAGMENTS
VON
PMOBLOOO
IN
DEN
VEKTOR
PJK356
67
3.3.
DELETION
DES
ERYTHROMYCINRESISTENZGENS
AUS
PGB
100
68
TEIL
B:
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
GENETISCHEN
TRANSFER
POTENTIAL
VON
LACTOBACILLUS
CURVATUS
UND
L.
SAKE
69
4.
DNS-SONDEN
ZUR
DETEKTION
VON
IS-ELEMENTEN
69
4.1.
LOKALISIERUNG
VON
IS-ELEMENTEN
IM
GENOM
VON
LACTOBACILLUS
CURVATUS
UND
L.
SAKE
STAEMMEN
69
5.
KLONIERUNG
DES
3,4
KB
CORL-FRAGMENTS
VON
L.
CURVATUS
LTH684
72
5.1.
SCREENING
DER
TRANSFORMANTEN
73
6.
ERSTELLEN
EINER
RESTRIKTIONSKARTE
73
7.
UEBERPRUEFUNG
DER
HERKUNFT
DES
3,4
KB
CORI-FRAGMENTS
74
8.
SEQUENZANALYSE
DES
3,4
KB
ECORI-FRAGMENTS
AUS
L.
CURVATUS
LTH684
75
8.1.
SEQUENZIERSTRATEGIE
75
8.2.
DNS-UND
AMINOSAEURESEQUENZ
78
8.3.
STRUKTURELLE
ANALYSE
UND
OFFENER
LESERAHMEN
79
8.4.
GC-GEHALT
80
8.5.
KODONGEBRAUCH
80
8.6.
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG
81
8.7.
TERMINATOREN
81
9.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZWEITEN
IS57-HOMOLOGEN
SEQUENZ
VON
L.
CURVATUS
LTH684
82
9.1.
ABSTAND
DER
IS-ELEMENTE
ZUEINANDER
AUF
DEM
GENOM
VON
L.
CURVATUS
LTH684
82
9.2.
UEBERPRUEFUNG
DES
ZWEITEN
IS-ELEMENTS
AUF
DAS
VORHANDENSEIN
DES
STOPKODONS
IM
TNP-GEN
84
9.3.
KLONIERUNG
DES
1,6
KB
CORI-FRAGMENTS
VON
L.
CURVATUS
LTH684
85
9.3.1.
SCREENING
DER
TRANSFORMANTEN
86
9.3.2.
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
PLASMIDS
86
9.4.
SEQUENZANALYSE
DES
1,6
KB
CORI-FRAGMENTES
VON
L.
CURVATUS
LTH684
87
9.4.1.
DNS-UND
AMINOSAEURESEQUENZ
88
9.4.2.
STRUKTURELLE
ANALYSE
UND
OFFENER
LESERAHMEN
89
9.4.3.
GC-GEHALT
89
9.4.4.
KODONGEBRAUCH
89
9.4.5.
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG
90
V
INHALTSVERZEICHNIS
10.
HYBRIDISIERUNG
ZUR
DETEKTION
VON
IS-ELEMENTEN
IM
GENOM
VON
LACTOBACILLUS
SOFE-STAEMMEN
91
11.
SILENT
SS-GALAKTOSIDASEGENE
IN
LACTOBACILLUS
SAKE
92
11.1.
SEQUENZANALYSE
DER
MUTIERTEN
REGION
93
IV.
DISKUSSION
95
1.
"FOOD
GRADE"-INTEGRATIONSSYSTEME
95
1.1.
DER
THERMOSENSITIVE
INTEGRATIONSVEKTOR
PG
+
HOST5
95
1.2.
DER
NICHT-REPLIKATIVE
INTEGARTIONSVEKTOR
PORI19
98
2.
"FOOD
GRADE"-VEKTOREN
100
2.1.
DER
VEKTOR
PJK356
ALS
SICHERHEITSVEKTOR
100
2.2.
DER
VEKTOR
PG
+
HOST5
ALS
SICHERHEITSVEKTOR
102
3.
VORKOMMEN
UND
VERTEILUNG
VON
IS-ELEMENTEN
IN
LACTOBACILLUS
CURVATUS
UND
L.
SAKE
104
3.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISS/-HOMOLOGEN
INSERTIONSELEMENTE
VON
LACTOBACILLUS
CURVATUS
LTH684
107
3.1.1.
HOMOLOGIEVERGLEICH
DER
OFFENEN
LESERAHMEN
VON
ISSHLCL
UND
\SSHLC2
MIT
BEKANNTEN
ISS/-ELEMENTEN
110
4.
SILENT
SS-GALAKTOSIDASEGENE
IN
LACTOBACILLUS
SAKE
113
V.
ZUSAMMENFASSUNG
115
VI.
LITERATUR
118
VII.
ANHANG
135 |
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