Rekombinante Herstellung und Charakterisierung des "Leech Derived Tryptase Inhibitors" (Form C) sowie abgeleiteter Varianten:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
A
BKUERZUNGSVERZEICHNIS
A
Z
USAMMENFASSUNG
I
B
E
INLEITUNG
B.1
PROTEINASE-INHIBITOREN
3
B.2
INTERAKTION
VON
SERINPROTEINASE
UND
INHIBITOR
3
B3
KAZAL-TYP
INHIBITOREN
5
B.4
HUMANE
MASTZELL-TRYPTASE
10
B.5
THROMBIN
11
B.6
METHODISCHE
GRUNDLAGEN
13
B.7
AUFGABENSTELLUNG
14
C
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
C.1
GERAETE
16
C.1.1
SUBSTANZEN
UND
MATERIALIEN
17
C.L.1.1
ESCHERICHIA
COLI
UND
SACCHAROMYCES
CEREVIRIAE-STAEMME
22
C.1.1.
2
PLASMID-VEKTOREN
23
C2
METHODEN
C.2.1
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
26
C.2.1.1
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
26
C.2.
1.2
ANZUCHT
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
28
C.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
29
C.2.2.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
29
C.2.2.2
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
31
C.2.2.3
GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA
31
C.2.2.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
32
C.2.2.5
DNA-SEQUENZANALYSE
32
C.2.2.6
HYBRIDISIERUNG
VON
KOMPLEMENTAEREN
OLIGONUKLEOTIDEN
33
C.2.2.7
SPALTUNG
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
33
C.2.2.8
DEPHOSPHORYLIERUNG
DER 5
'
-ENDEN
VON
LINEARISIERTER
VEKTOR-DNA
33
C.2.2.9
PHOSPHORYLIERUNG
DER
FREIEN
5
'
-ENDEN
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
34
C.2.2.
10
ERZEUGUNG
GLATTER
DNA-ENDEN
DURCH
EINE
T4-POLYMERASE-AUFFTILLREAKTION
34
C.2.2.
11
LIGIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
T4-DNA-LIGASE
34
C.2.2.12
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
UND
S.
CEREVISIAE
35
C.2.2.13
IN
VFTRO
-TRANSKRINTION
UND
-TRANSLATION
VON
PLASMID-DNA
37
I
NHALTSVERZEICHNIS
II
C.2.3
KONSTRUKTION
UND
KLONIERUNG
DES
SYNTHETISCHEN
GRUNDGENS
FUER
RLDTI-C
UND
DER
GENE
FUER
DIE
ABGELEITETEN
VARIANTEN
37
C.2.3.
1
SYNTHETISCHES
RLDTI-C
GRUNDGEN
38
C.2.3.2
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSVEKTOREN
FUER
DAS
RLDTI-C
GEN
38
C.2.3.3
KONSTRUKTION
UND
KLONIERUNG
DER
GENE
FUER
DIE
RLDTI-VARIANTEN
40
C.2.4
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
INHIBITOREN
43
C.2.4.
1
ISOLIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
GLUTATHION-S-TRANSFERASE/LDTI-FUSIONS
PROTEIN
AUS
DEM
ZYTOPLASMA
VON
E.
COLI
43
C.2.4.2
ISOLIERUNG
EINER
PERIPLASMAFRAKTION
AUS
E.COLI
43
C.2.4.3
REINIGUNG
DER
SEKRETIERTEN
INHIBITOREN
AUS
DEM
KULTURUEBERSTAND
VON
S.
CEREVISIAE
44
C.2.5
HPLC-ANALYSE
VON
RLDTI-C
UND
ABGELEITETER
VARIANTEN
46
C.2.6
KONZENTRIERUNG
UND
ENTSALZUNG
VON
PROTEINEN
46
C.2.7
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
47
C.2.8
PROTEIN-ELEKTROPHORESE
47
C.2.9
AMINOSAEURE-SEQUENZIERUNG
48
C.2.10
MASSENSPEKTROMETRIE
48
C.2.11
ZIRKULARDICHROISMUS
49
C.2.12
2D-1H-NMR-STRUKTURANALYSE
VON
RLDTI-C
50
C.2.13
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
50
C.2.
13.1
'
ACTIVE
SITE
'
TITRATION
VON
PROTEINASEN
50
C.2.13.
2
TRYPSIN-HEMMTEST
51
C.2.13.3
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
DER
ENZYM/INHIBITOR-KOMPLEXE
UNTER
GLEICHGEWICHTSBEDINGUNGEN
51
C.2.14
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
54
C.2.14.1
GERINNUNGSHEMMUNG
54
C.2.14.2
HEMMUNG
DER
THROMBIN-INDUZIERTEN
THROMBOZYTEN-AGGREGATION
56
C.2.
14.3
HEMMUNG
DER
THROMBIN-BILDUNG
AUS
PROTHROMBIN
56
C.2.14.4
HEMMUNG
DER
HIV-1
REPLIKATION
IM
ZELLKULTUR-MODELL
57
D
E
RGEBNISSE
D.L
KONSTRUKTION
UND
KLONIERUNG
DER
SYNTHETISCHEN
GENE
59
D.
1.1
DESIGN
UND
KONSTRUKTION
EINES
SYNTHETISCHEN
RLDTI-C
GRUNDGENS
59
D.L.
2
KONSTRUKTION
VON
EXPRESSIONSVEKTOREN
61
D.L.
3
KONSTRUKTION
VON
RLDTI-C
VARIANTEN
63
D.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION/TRANSLATION
VON
RLDTI-C
UND
EXPRESSIONS
VERSUCHE
IN
E.
COLI
65
D3
EXPRESSION
VON
RLDTI-C
UND
ABGELEITETER
VARIANTEN
IN
CEREVISIAE,
REINIGUNG
UND
VERGLEICHENDE
PROTEINCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
69
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
D.3.
1
EXPRESSION
VON
RLDTI-C
UND
DER
ABGELEITETEN
VARIANTEN
69
D.3.2
PRAEPARATIVE
ANZUCHT
UND
ISOLIERUNG
VON
RLDTI-C
UND
DER
VARIANTEN
70
D.3.3
VERGLEICHENDE
PROTEINCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
INHIBITOREN
75
D.3.3.
1
SDS-POLYACRYLAMID-ELEKTROPHORESE
75
D.3.3.2
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
77
D.3.3.3
HPLC-ANALYSE
78
D.3.3.4
AMINOSAEURESEQUENZ-ANALYSE
80
D.3.3.5
BESTIMMUNG
DER
MOLEKULAREN
MASSE MITTELS
MASSENSPEKTROMETRIE
81
D.4
UNTERSUCHUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
UND
RAUMSTRUKTUR
VON
RLDTI-C
83
D.4.
1
ANALYSE
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
VON
RLDTI-C
MITTELS
CD-SPEKTROSKOPIE
84
D.4.2
BESTIMMUNG
DER
RAUMSTRUKTUR
VON
RLDTI-C
IN
LOESUNG
DURCH
MEHR
DIMENSIONALE
NMR-ANALYSE
85
DJ
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
RLDTI-C
UND
DER
VARIANTEN
87
D.5.1
PROZENTUALE
SPEZIFISCHE
AKTIVITAET
DER
INHIBITORLOESUNG
87
D.5.2
HEMMEIGENSCHAFTEN
VON
REKOMBINANTEM
LDTI-C
87
D.5.2.1
RLDTI-C
VERSUS
NATUERLICHER
LDTI-C
88
D.5.2.2
BEEINFLUSSUNG
DER
HIV-1
REPLIKATION
DURCH
RLDTI-C
IM
ZELLKULTURMODELL
90
D.5.3
INTERAKTION
DER
RLDTI-C
VARIANTEN
MIT
HUMANER
MASTZELL-TRYPTASE,
TRYPSIN
UND
CHYMOTRYPSIN
91
D.5.4
HEMMEIGENSCHAFTEN
VON
RLDTI-C
UND
ABGELEITETER
VARIANTEN
GEGENUEBER
A-THROMBIN
95
D.5.4.1
EINFLUSS
VON
RLDTI-C
UND
ABGELEITETER
VARIANTEN
AUF
DAS
BLUTGERINNUNGS
SYSTEM
99
E
D
ISKUSSION
ELI
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
RLDTI-C
UND
ABGELEITETER
VARIANTEN
103
EJ
REKOMBINANTER
LDTI-C
VERSUS
NATUERLICHEM
LDTI-C
107
E_3
BESTIMMUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTURELEMENTE
UND
DER
RAUMSTRUKTUR
IN
LOESUNG
108
E.4
INTERAKTION
VON
RLDTI-C
MIT
HUMANER
MASTZELL-TRYPTASE
110
E.5
HEMMUNG
DER
HIV-1
REPLIKATION
DURCH
RLDTI-C
115
E.6
EINFLUSS
VON
AMINOSAEURE-SUBSTITUTIONEN
UND
-INSERTIONEN
AUF
DIE
THROMBIN/RLDTI-C
INTERAKTION
117
E.7
AUSBLICK
123
F
LITERATURVERZEICHNIS
125
G
A
NHANG
H
L
EBENSLAUF |
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