Effekte von insulinotropen Substanzen an der Insulinomazellinie INS-1: Beeinflussung der GRP-Wirkung und -Rezeptorzahl durch GIP
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1996
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| Beschreibung: | Münster, Univ., Diss., 1996 |
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| adam_text | PHARMAKOLOGIE UND TOXIKOLOGIE EFFEKTE VON INSULINOTROPEN SUBSTANZEN AN
DER INSULINOMAZELLINIE INS-1; BEEINFLUSSUNG DER GRP-WIRKUNG UND
-REZEPTORZAHL DURCH GIP INAUGURALDISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN IM FACHBEREICH CHEMIE DER
MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER WESTFAELISCHEN
WILHELMS-UNIVERSITAET MUENSTER VORGELEGT VON HENDRIK KLOSS AUS TELGTE
-1996- INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 11
INSULINSEKRETION 1 1.1.1 INSULIN 1 1.1.2 GLUCOSEINDUZIERTE
INSULINSEKRETION 1 1.1.3 MEDIATOREN DER INSULINSEKRETION 3 1.1.3.1
CALCIUM 3 1.1.3.2 ADENYLYLCYCLASE, CAMP UND PROTEINKINASE A 4 1.1.3.3
PHOSPHOLIPASE C, IP 3 UND DAG 5 1.1.3.4 PROTEINKINASE C 5 1.1.4
INKRETINKONZEPT 8 1.1.5 HORMONPEPTIDE 9 1.1.5.1 GIP 9 1.1.5.2
GLP-L-(7-36)AMID 11 1.1.5.3 ANP 13 1.1.6 CHOLINERGE BEEINFLUSSUNG DER
INSULINSEKRETION 14 1.1.7 PANKREATISCHE NEUROPEPTIDE 16 1.1.7.1
EINFUEHRUNG 16 1.1.7.2 CGRP , 17 1.1.7.3 CHOLEZYSTOKININ 19 1.1.7.4
BOMBESINAEHNLICHE PEPTIDE DER SAEUGETIERE 20 1.2 BOMBESINREZEPTOREN DER
SAEUGETIERE 24 1.3 ANATOMIE DER LANGERHANSSCHEN INSEL 29 1.4 B-ZELLINIEN
30 1.5 ZIELSETZUNG 35 INHALTSVERZEICHNIS 2 MATERIAL 36 2.1 ZELLKULTUR 36
2.2 GERAETE UND COMPUTERPROGRAMME 36 2.3 CHEMIKALIEN, KITS UND ENZYME 37
2.4 LOESUNGEN 39 2.4.1 ZELLKULTUR 39 2.4.1.1 KULTURMEDIEN 39 2.4.1.2
MEDIENZUSAETZE 42 2.4.1.3 CALCIUMLOESUNG 42 2.4.1.4 TRYPSIN/EDTA-LOESUNG 42
2.4.1.5 EINFRIERMEDIUM 42 2.4.2 PROTEINBESTIMMUNG 43 2.4.3
INSULINSEKRETIONSVERSUCHE 43 2.4.3.1 KREBS-RINGER-HEPES-PUFFER 43
2.4.3.2 STAMMLOESUNGEN DER SUBSTANZEN 44 2.4.4 INSULIN-RADIOIMMUNOASSAY
45 2.4.4.1 WASCHPUFFER 45 2.4.4.2 ISOTOPENPUFFER 45 2.4.4.3
STAMMLOESUNGEN 45 2.4.5 VERDRAENGUNGSSTUDIEN 46 2.4.5.1 125 I-GRP- UND 125
I-CCK-8-LOESUNG 46 2.4.5.2 KRH-INKUBATIONSLOESUNG 47 2.4.6 TRANSFORMATION
UND VERMEHRUNG VON BAKTERIEN.... 47 2.4.7 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG
DER PLASMIDE 47 2.4.8 IN-VITRO-GENERATION DER RNA-SONDEN 48 2.4.9
GELELEKTROPHORESE 48 INHALTSVERZEICHNIS DI 2.4.10 RNA-ISOLIERUNG 48
2.4.11 MRNA-ISOLIERUNG 49 2.4.12 BLOTTING 49 2.4.13 HYBRIDISIERUNG 49
2.4.14 CHEMILUMINESZENZDETEKTION 49 2.4.15 H 2 O (DMPC) UND VERSCHIEDENE
PUFFER 50 3 METHODEN 51 3.1 ZELLKULTUR 51 3.1.1 SUBKULTIVIERUNG 51 3.1.2
ZELLZAEHLUNG UND VITALITAETSTEST 53 3.1.3 KRYOKONSERVIERUNG : 54 3.1.3.1
EINFRIEREN 54 3.1.3.2 AUFTAUEN 54 3.2 PROTEINBESTIMMUNG 55 3.3
INSULINSEKRETION 57 3.4 BESTIMMUNG DER INSULINMENGE 58 3.5
VERDRAENGUNGSSTUDIEN 59 3.6 NACHWEIS DER GRP-REZEPTOR- UND DER
NMB-REZEPTOR-MRNA 61 3.6.1 TRANSFORMATION UND VERMEHRUNG VON BAKTERIEN
61 3.6.1.1 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN E. COLI-BAKTERIEN 61 3.6.1.2
TRANSFORMATION 62 3.6.1.3 VERMEHRUNG DER TRANSFORMIERTEN BAKTERIEN 62
3.6.2 ISOLIERUNG VON PLASMIDEN 63 3.6.2.1 MINI- UND MAXIPRAEPARATION 63
3.6.2.2 BESTIMMUNG DER PLASMIDKONZENTRATION 64 3.6.2.3 KONTROLLE DER
TRANSFORMATION DURCH RESTRIKTIONSANALYSE 65 INHALTSVERZEICHNIS 3.6.3
HERSTELLUNG DER MRNA-SONDE 66 3.6.3.1 LINEARISIERUNG DER PLASMID-DNA 66
3.6.3.2 AUFREINIGUNG DER PLASMID-DNA 66 3.6.3.3 IN-VITRO-GENERATION DER
RNA-SONDE 67 3.6.3.4 BESTIMMUNG DER RNA-SONDENKONZENTRATION 68 3.6.4
RNA-ISOLIERUNG 68 3.6.5 MRNA-ISOLIERUNG 70 3.6.6 MRNA-NACHWEIS 71
3.6.6.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 71 3.6.6.2 BLOTTING 71 3.6.6.3
HYBRIDISIERUNG 72 3.6.6.4 CHEMILUMINESZENZDETEKTION : 72 3.7 STATISTIK
73 4 ERGEBNISSE 74 4.1 WACHSTUMSVERHALTEN VON INS-L-ZELLEN 74 4.1.1
KULTURFLASCHEN 74 4.1.1.1 WACHSTUM UEBER ACHT TAGE 74 4.1.1.2
GEGENUEBERSTELLUNG VON ZELLZAEHLUNG UND PROTEINBESTIMMUNG 74 4.1.2
MULTIWELLS 76 4.1.2.1 WACHSTUM UEBER ACHT TAGE 76 4.1.2.2
VERGLEICHBARKEIT INNERHALB EINZELNER WELLS 77 4.1.2.3 VERGLEICH
VERSCHIEDENER VORINKUBATIONSBEDINGUNGEN 78 4.1.3 WACHSTUM VON
INS-L-ZELLEN IN FBS-ARMEN MEDIUM 79 4.2 GLUCOSEINDUZIERTE
INSULINSEKRETION VON INS-L-ZELLEN 79 INHALTSVERZEICHNIS 4.3
BEEINFLUSSUNG DER GLUCOSEINDUZIERTEN INSULINSEKRETION DURCH VERSCHIEDENE
ENZYME 82 4.3.1 PROTEINKINASE C 82 4.3.2 GUANYLYLCYCLASE 84 4.3.3
ADENYLYLCYCLASE 84 4.3.4 PHOSPHOLIPASE C 88 4.4 VERDRAENGUNGSSTUDIEN 99
4.4.1 CCK-8-BINDUNGSSTELLE 99 4.4.2 GRP-BINDUNGSSTELLE 99 4.4.2.1
CHARAKTERISIERUNG DER BINDUNGSSTELLE 99 4.4.2.2 BEEINFLUSSUNG DER
GRP-BINDUNG 103 4.5 GRP-REZEPTOR-/NMB-REZEPTOR-MRNA 108 5 DISKUSSION 110
5.1 CHARAKTERISIERUNG DER INS-L-ZELLEN 110 5.1.1 WACHSTUMSVERHALTEN 110
5.1.2 ERSATZ DES KOMPLETTMEDIUMS DURCH EIN SERUMARMES MEDIUM 111 5.1.3
GLUCOSEINDUZIERTE INSULINSEKRETION 112 5.1.4 BEEINFLUSSUNG DER
GLUCOSESTIMULIERTEN INSULINSEKRETION DURCH VERSCHIEDENE ENZYME 114
5.1.4.1 PROTEINKINASE C 114 5.1.4.2 GUANYLYLCYCLASE 116 5.1.4.3
ADENYLYLCYCLASE 116 5.1.4.4 PHOSPHOLIPASE C 119 5.2 GRP-REZEPTOR AN
INS-L-ZELLEN 125 5.2.1 NACHWEIS DES GRP-REZEPTORS :.... 125 5.2.1.1
VERDRAENGUNGSSTUDIEN 125 5.2.1.2 MRNA-DETEKTION 126 _VI
INHALTSVERZEICHNIS 5.2.2 BEEINFLUSSUNG DER GRP-REZEPTORZAHL UND DER
GRP-WIRKUNG 128 5.2.2.1 REGULIERUNG DER GRP-REZEPTOREN 128 5.2.2.2
INSULINOTROPER EFFEKT VON GRP NACH GIP-VORBEHANDLUNG 130 6
ZUSAMMENFASSUNG 133 6.1 FRAGESTELLUNG 133 6.2 ERGEBNISSE 134 6.3
SCHLUSSFOLGERUNGEN 135 7 ANHANG 137 7.1 ANHANG A: UEBERSICHT DER STUDIEN
AN BOMBESINREZEPTOREN 137 7.2 ANHANG B: UEBERSICHT DER B-ZELLINIEN 157
7.3 ANHANG C: PLASMIDE 160 7.3.1 RESTRIKTIONSKARTE PSP64-GRP-R 160 7.3.2
RESTRIKTIONSKARTE PSP64-NMB-R..; 161 7.3.3 DNA- UND AMINOSAEURESEQUENZEN
DER INSERTS 162 7.4 ANHANG D: DATEN ZUR INSULINSEKRETION 163 8
LITERATURVERZEICHNIS 165
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