Ektopische Expression von Fettsäurebindungsprotein des Herztyps:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN UND DEFINITIONEN VII
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG I
1.1 EINLEITUNG 2
1.2 PROBLEMSTELLUNG 9
2 ERGEBNISSE 10
2.1 ALLGEMEINE ANMERKUNGEN 11
2.2 DIE VERWENDETEN ZELLSYSTEME 11
2.3 AUSWAHL DER PLASMIDE UND KONSTRUKTION DER VEKTOREN 13
2.3.1 AUSWAHL DER VEKTOREN 13
2.3.2 DER VEKTOR PMAMNEO-LUC 14
2.3.3 DER VEKTOR PCDNA3 15
2.3.4 AUSWAHL DER INSERTIONSSEQUENZEN 16
2.3.5 KLONIERUNGSSTRATEGIE 17
2.3.5.1 VEKTOREN AUF DER BASIS VON PMAMWEO 18
2.3.5.2 RESTRIKTIONSANALYSE DER VEKTOREN
PMAMWEO-BH-FABP-.SE/7SE UND 19
PMAMWEO-BH-FABP-OWTOEWSE
2.3.5.3 VEKTOREN AUF DER BASIS VON PCDNA3 21
2.3.5.4 RESTRIKTIONSANALYSE DER VEKTOREN PCDNA-BH-FABP UND PCDNA R126Q
23
2.4 TRANSFEKTIONEN AN EUKARYOTISCHEN ZELLEN 23
2.4.1 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN 23
2.4.2 TECHNIKEN ZUR TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN 24
2.4.2.1 CALCIUMPHOSPHAT-METHODE 24
2.4.2.2 TRANSFECTAM-, LIPOFECTIN-METHODE 25
2.4.2.3 ANDERE TRANSFEKTIONSMETHODEN 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.5 TRANSFEKTIONEN MIT DEM VEKTOR PMAM/IEO-LUC UND DAS LUCIFERASE-ASSAY
26
2.5.1 DAS LUCIFERASE-ASSAY 26
2.5.2 T RANSFEKTIONEN MIT T RANSFECTAM- UND LIPOFECTIN-METHODE 27
2.5.3 TRANSFEKTIONEN MIT DER DOTAP- UND DER CA3(P0
4)2-METHODE 28
2.6 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE 32
2.6.1 ALLGEMEINES 32
2.6.2 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE ZUR AUFFINDUNG VON VIMENTIN UND AKTIN
IN 33
HEPG2 UND C2
2.7 TRANSIENTE TRANSFEKTIONEN VON HEPG2-ZELLEN MIT PMAMNEO-BLL-FABP 36
-SENSE UND -ANTISENSE
2.7.1 GEWINNUNG DES LOESLICHEN PROTEINS DER TRANSFIZIERTEN HEPG2-ZELLEN
36
2.7.2 NACHWEIS VON BH-FABP IN LYSATEN TRANSFIZIERTER HEPG2-ZELLEN
MITTELS
ELISA 36
2.8 KOTRANSFEKTIONEN VON HEPG2-ZE!LEN MIT PMAM/IEO-LUC UND PMAMNEO- 36
BH-FABP-SESE BZW. -ANTISENSE
2.8.1 TRANSFEKTION VON HEPG2-ZELLEN MIT PCDNA-BH-FABP UND PCDNA-R126Q 37
2.9 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN AN TRANSIENT TRANS- 37
FIZIERTEN ZELLEN
2.9.1 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN 38
2 .9.2 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPISCHEN UNTERSUCHUNGEN AN TRANSIENT MIT
39
PMAMEO-BH-FABP-SESE UND
-ANTISENSE TRANSFIZIERTEN HEPG2- UND
C2C12-ZELLEN
2.10 STABILE TRANSFEKTIONEN EUKARYOTISCHER ZELLEN 41
2.10.1 MTT-VITALITAETSTEST AN DEN EINGESETZTEN ZELLINIEN 41
2.10.2 STABILE TRANSFEKTION VON HEPG2, C2 UND C2C12 43
2.10.3 SELEKTION UND KLONIERUNG 43
2.11 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE AN STABIL TRANSFIZIERTEN KLONEN DER 44
VERSCHIEDENEN ZELLINIEN
2.12 WEITERE KULTIVIERUNG UND SUBKLONIERUNG DER STABIL TRANSFIZIERTEN 46
KLONEN DER VERSCHIEDENEN ZELLINIEN
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.13 NACHWEIS VON HERZTYP-FABP IN STABIL TRANSFLZIERTEN KLONEN DER 47
VERSCHIEDENEN ZELLINIEN MITTELS ELISA
2.14 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ- UND LUERSER-5CAN//J^-MIKROSKOPIE AN 48
STABIL TRANSFLZIERTEN KLONEN DER VERSCHIEDENEN ZELLINIEN
2.15 VERGLEICH DER PROLIFERATION STABIL-TRANSFLZIERTER UND
NICHT-TRANSFIZIERTER 52
KULTUREN DER VERSCHIEDENEN ZELLINIEN
2.15.1 ALLGEMEINES 52
2.15.2 DAS PROLIFERATIONSVERHALTEN DER NICHT-TRANSFIZIERTEN ZELLINIEN 52
2.15.3 DAS PROLIFERATIONSVERHALTEN TRANSFIZIERTER C2-ZELLEN 5 3
2.15.4 DAS PROLIFERATIONSVERHALTEN TRANSFIZIERTER C2C12-ZELLEN 55
2.15.5 DAS PROLIFERATIONSVERHALTEN TRANSFIZIERTER HEPG2-ZELLEN 55
3 DISKUSSION 56
4
ZUSAMMENFASSUNG 72
5 METHODEN
74
5.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 75
5.1.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME 75
5.1.2 NAEHRMEDIEN FUER
E COLI 75
5.1.3 ANLEGEN VON
E. CO/Z-STAMMKULTUREN 76
5.1.4 AGARKULTUREN VON
E. COLI 76
5.1.5 UEBEMACHTKULTUREN 76
5.1.6 HERSTELLUNG KOMPETENTER ECO/Z-ZELLEN
5.2 PRAEPARATION HOMOGENER DNA 77
5.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 77
5.2.1.1 MINIPLASMIDISOLIERUNG (10 PG) NACH QIAGEN 77
5.2.1.2 MINIPLASMIDISOLIERUNG (5 PG) NACH PROMEGA 79
5.2.1.3 PLASMIDISOLIERUNG IM 2 MG MASSSTAB (MACHEREY & NAGEL) 80
5.2.2 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN 81
5.2.3 REINIGUNG VON DNA 82
5.2.3.1 ETHANOL-UND ISOPROPANOLFALLUNGEN 82
5.2.3.2 PHENOLEXTRAKTION
83
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.2.3.3
GENECLEAN 11 ZUR AUFREINIGUNG VON DNA 84
5.2.4 KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA
5.3 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 85
5.3.1 VERWENDETE PLASMIDE 85
5.3.2 RESTRIKTIONSSPALTUNG DER PLASMID-DNA FUER DIE KLONIERUNG 86
5.3.3 DEPHOSPHORYLIERUNG 86
5.3 .4 GLAETTEN DER ENDEN VON RESTRIKTIONSPRODUKTEN 87
5.3.5 LIGATION 88
5.3.6 ANBRINGEN DER
LINKER 88
5.3.7 RESTRIKTIONSSPALTUNG NACH DER LIGATION DER
LINKER 89
5.3.8 TRANSFORMATION 90
5.4 QUALITATIVE UNTERSUCHUNGEN VON DNA 91
5.4.1 RESTRIKTIONSSPALTUNGEN VON DNA 91
5.4.2 NICHTDENATURIERENDE ANALYTISCHE UND PRAEPARATIVE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE 93
5.4.3 BESTIMMUNG VON FRAGMENTLAENGEN IM AGAROSEGEL 94
5.5 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 95
5.5.1 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 95
5.5.2 ANFARBEN VON PROTEINEN MIT
COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 96
5.5.3 ANFARBEN VON PROTEINEN MIT SILBER (ANSORGE, 1985) 96
5.5.4 IMMUNOLOGISCHE ANFAERBUNG VON PROTEINEN AUF MEMBRANEN 97
5.5.5 ISOLIERUNG VON AFFINITAETSGEREINIGTEN ANTIKOERPERN 99
5.5.6 BIOTINYLIERUNG VON ANTIKOERPERN 99
5.5.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 99
5.5.8
SANDWICH-ELISA ZUM NACHWEIS VON BH-FABP 100
5.6 ZELLKULTUR UND ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 101
5.6.1 ALLGEMEINE ARBEITSMETHODEN IN DER ZELLKULTUR 101
5.6.2 VORBEREITUNG DER VERWENDETEN GERAETE UND LOESUNGEN 101
5.6.2.1 VORBEHANDLUNG VON NEUEN GLASPIPETTEN 101
5.6.2.2 REINIGUNG VERWENDETER GLASPIPETTEN 101
5.6.2.3 STERILISIERUNG VON METALL-UND GLASGERAETEN 102
5.6.2.4 STERILISIERUNG VON THERMOSTABILEN LOESUNGEN 102
INHALTSVERZEICHNIS
V
5.6.2.5 STERILISIERUNG VON THERMOLABILEN LOESUNGEN 102
5.6.2.6 STERILISIERUNG VON KUNSTSTOFFARTIKELN 103
5.6.2.7 KULTURGEFASSE 103
5.6.2.8 REINIGUNG UND OBERFLAECHENBESCHICHTUNG VON DECKGLAESERN 103
5.6.3 ZELLEN IN PASSAGE 104
5.6.3.1 VERWENDETE MEDIEN UND MEDIENZUSAETZE 104
5.6.3.2 MEDIENWECHSEL BEI ADHAERENTEN ZELLEN 105
5.6.3.3 PASSAGE VON ADHAERENTEN ZELLEN 107
5.6.3.4 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 108
5.6.4 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 109
5.6.5 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 109
5.6.6 TEST AUF MYKOPLASMEN 111
5.6.7 BEHANDLUNG VON MYKOPLASMENKONTAMINATIONEN IN ZELLKULTUREN 111
5.6.8 VITALITAETSFARBUNG 111
5.6.8.1 MTT-VITALITAETSTEST 111
5.6.9 AUFBEREITUNG VON ZELLKULTURPROBEN 112
5.6.10 T RANSFEKTIONSMETHODEN 112
5.6.10.1 CALCIUMPHOSPHAT-METHODEN 112
5.6.10.2 DOTAP- METHODE 113
5.6.10.3 LIPOFECTIN-METHODE 114
5.6.10.4 TRANSFECTAM-METHODE 115
5.6.11 GEWINNUNG STABIL TRANSFIZIERTER KLONE 115
5.6.12 SZINTIGRAPHISCHES LUCIFCRASE-ASSAY 116
5.6.13 HERSTELLUNG VON LUCIFERASE-LOESUNGEN DEFINIERTER KONZENTRATION 117
6 GERAETE UND CHEMIKALIEN 118
6.1 GERAETE 119
6.1.1 FPLC-ANLAGE 119
6.1.2 ZENTRIFUGEN 119
6.1.3 SPEKTROMETER 119
6.1.4 ELEKTROPHORESEANLAGEN 119
6.1.5 SPANNUNGSQUELLEN 119
INHALTSVERZEICHNIS
VI
6.1.6 SONSTIGE GERAETE 119
6.2 CHEMIKALIEN 120
6.3 MATERIALIEN 120
7 LITERATURVERZEICHNIS 121
ANHANG 130
LEBENSLAUF 131
DANKSAGUNG 132 |
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