Der Cellulose-Abbau von Clostridium stercorarium: Reinigung, biochemische Charakterisierung, Genklonierung und Sequenzanalyse der Cellobiose- und Cellodextrin-Phosphorylase
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
1997
|
| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Berichte aus der Biologie
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 1996 |
| Beschreibung: | VIII, 162 S. Ill., graph. Darst. |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
A.
EINLEITUNG
_
I
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
_
7
1.
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE.
-----------
.
------
.7
2.
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG.YY.9
2.1.
NAEHRMEDIEN
UND
SUBSTRATE
.
9
2.2.
ANZUCHT
.
11
2.2.1.
INDUKTION
DES
T5-PROMOTORS
.
11
2.3.
STAMMHALTUNG
.
12
3.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.13
3.1.
ZELLEMTE
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
13
3.2.
AUFKONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
MITTELS
MIKROKONZENTRATOREN
.
13
3.3.
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
.
13
3.4.
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
.
14
3.4.1.
HYDROLYSE
VON
ARYL-SS-GLYKOSIDEN
.
14
3.4.2.
BESTIMMUNG
VON
D-GLUKOSE-1-PHOSPHAT
.
15
3.5.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
16
3.5.1.
HERSTELLUNG
DER
GELE
.
16
3.5.2.
PROBENVORBEREITUNG
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
.
17
3.5.3.
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
.
18
3.6.
PROTEINREINIGUNG
MITTELS
FPLC
.
18
3.6.1.
PROBENVORBEREITUNG
UND
PROBENAUFTRAG
.
19
3.6.2.
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
20
3.6.3.
CHROMATOFOKUSSIERUNG
AN
MONOP
.
20
3.6.4.
HYDROPHOBE-INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE
(HIC)
.
21
3.6.5.
GROESSENAUSSCHLUBCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
GELFILTRATION
.
22
3.6.6.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
MIT
HILFE
DER
GELFILTRATION
.
23
3.6.7.
HYDROXYLAPATIT
.
23
3.7.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEINE
.
24
3.7.1.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
24
3.7.2.
TEMPERATUR-OPTIMUM
.
24
3.7.3.
THERMOSTABILITAET
.
24
3.7.4.
PH-OPTIMUM
.
24
N
3.7.5.
CHEMOSTABILITAET
.
24
3.7.6.
KINETISCHE
MESSUNGEN
.
25
3.7.7.
BESTIMMUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZEN
.
25
4.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
M
4.1.
PRAEPARATION
VON
DNA
.
26
4.1.1.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
CLOSTRIDIUM
STERCORARIUM
.
26
4.1.2.
PLASMIDPRAEPARATION
IM
KLEINEN
MASSSTAB
.
26
4.1.3.
PLASMIDPRAEPARATION
MITTELS
QIAGEN-MINIPREP
.
27
4.1.4.
REINIGUNG
VON
DNA
MITTELS
WIZARD-MINIPREP
.
27
4.1.5.
REINIGUNG
VON
PCR-DNA
MITTELS
QIAGEN-PCR-PURIFICATION-KIT
.
27
4.2.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
C.
STERCORARIUM
.
27
4.3.
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA
IN
WAESSRIGEN
LOESUNGEN
.
28
4.4.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
29
4.4.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
29
4.4.2.
ALKALISCHE
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG
.
29
4.4.3.
LIGATION
.
29
4.4.4.
SL-NUKLEASEBEHANDLUNG
.
29
4.4.5.
SUKZESSIVE
VERKLEINERUNG
VON
DNA
DURCH
EXONUKLEASE
III
.
29
4.4.6.
KINASIERUNG
EINES
OLIGONUKLEOTIDS
MIT
Y
32
P-ATP
.
30
4.4.7.
A
32
P-CTP
LABELLING
.
30
4.4.8.
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DIGOXIGENIN
.
31
4.5.
DNA/RNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
31
4.5.1.
DNA-GELELEKTROPHORESE
.
32
4.5.2.
GELELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMP-AGAROSE
.
32
4.5.3.
DENATURIERENDE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
.
32
4.6.
TRANSFER
VON
DNA/RNA
AUF
NYLONMEMBRAN
.
33
4.6.1.
SOUTHERN-BLOT
(RAPID-BLOT)
.
33
4.6.2.
NORTHERN-BLOT
.
34
4.6.2.1.
FAERBEN
DER
NYLONMEMBRAN
MIT
RNA
VOR
DER
HYBRIDISIERUNG
.
34
4.6.3.
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUS
BAKTERIENKOLONIEN
.
35
4.6.4.
FIXIEREN
VON
PLASMID-DNA
AUF
NYLONMEMBRAN
ALS
DOT-BLOT
.
35
4.6.5.
FIXIEREN
VON
GESAMT-RNA
AUF
NYLONMEMBRAN
ALS
DOT-BLOT
.
35
4.7.
HYBRIDISIERUNG
.
36
4.7.1.
HYBRIDISIERUNG
VON
AUF
NYLONMEMBRAN
GEBUNDENER
DNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
36
4.7.2.
HYBRIDISIERUNG
MIT
NICHT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
.
36
4.8.
GEZIELTE
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
HILFE
DER
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
37
4.9.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
KETTENABBRUCHMETHODE
.
38
4.9.1.
SEQUENZREAKTION
NACH
CYCLE-SEQUENCING
.
39
4.9.2.
SEQUENZREAKTION
MIT
THERMOSEQUENASE
.
39
4.9.3.
AUFTRENNUNG
DER
SEQUENZREAKTION
.
40
4.9.4.
AUSWERTUNG
DES
SEQUENZLAUFS
.
43
4.9.4.1.
BINDUNG
DES
KONJUGATES
BEI
DIG-MARKIERTEN
PRIMERN
.
43
4.9.4.2.
BINDUNG
DES
KONJUGATES
BEI
BIOTIN-MARKIERTEN
PRIMERN
.
44
4.9.4.3.
DETEKTION
MIT
FARBSTOFFNIEDERSCHLAG
.
44
4.9.4.4.
DETEKTION
MIT
CHEMILUMINESZENZ
.
45
4.10.
TRANSFER
VON
DNA
IN
E.
COLI
.
46
4.10.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
FUER
DIE
ELEKTROPORATION
.
46
4.10.2.
ELEKTROPORATION
VON
E.COLI
ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
.
46
4.10.3.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
MITTELS
PEG/DMSO
.
46
4.10.4.
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
E.
COLI
ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
.
46
4.11.
OLIGONUKLEOTIDE
.
47
C.
ERGEBNISSE
_
48
1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
TRANSKRIPTION
DER
GENE
CELY
UND
CELZ
IN
CLOSTRIDIUM
STERCORARIUM
.48
1.1.
SONDENAUSWAHL
UND
DEREN
LOKALISATION
AUF
DEM
GENOM
VON
C.
STERCORARIUM
.
48
1.2.
GESAMT-RNA-ISOLIERUNG
AUS
C.
STERCORARIUM
.
49
1.3.
GROESSENBESTIMMUNG
DES
CELY
UND
DES
CELZ
MRNA-TRANSKRIPTS
.
50
2.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
BEREICHS
UPSTREAM
VON
CELY
AUS
C.
STERCORARIUM
.52
2.1.
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DES
BEREICHS UPSTREAM
VON
CELY
IM
GENOM
.
52
2.2.
KLONIERUNG
DES
BEREICHS
UPSTREAM
VON
CELY
.
53
2.3.
SEQUENZIERUNG
DES
KLONIERTEN
4,6
KB
HINDNI-FRAGMENTS
.
54
2.4.
DER
OFFENE
LESERAHMEN
ORFX
.
56
3.
REINIGUNG
DER
CELLOBIOSE-/CELLODEXTRIN-PHOPHORYLASE
AUS
DEM
CYTOSOL
VON
C.
STERCORARIUM.
J9
3.1.
ANZUCHT
VON
C.
STERCORARIUM
.
59
3.2.
AUFTRENNUNG
DER
ENZYM-KOMPONENTEN
AUS
DEM
CYTOSOL
.
59
3.3.
AUFTRENNUNG
DER
CELLOBIOSE-ZCELLODEXTRIN-PHOPHORYLASE-AKTIVITAET
DURCH
HIC
.
61
3.4.
REINIGUNG
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
.
63
3.4.1.
CHROMATOGRAPHIE
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
AN
HYDROXYLAPATIT
.
63
IV
3.4.2.
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
AN
MONOQ
.
64
3.4.3.
REINIGUNG
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
UEBER
GELFILTRATION
.
65
3.4.4.
CHROMATOFOKUSSIERUNG
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
.
67
3.4.5.
BILANZIERUNG
DERAUFREINIGUNG
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
.
68
3.5.
REINIGUNG
DER
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE
.
70
3.5.1.
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
DER
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE
AN
MONOQ
.
70
3.5.2.
ABTRENNUNG
VERBLIEBENER
VERUNREINIGUNGEN
DURCH
GELFILTRATION
.
71
3.5.3.
CHROMATOFOKUSSIERUNG
DER
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE
.
72
3.5.4.
BILANZIERUNG
DER
AUFREINIGUNG
DER
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE
.
72
4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
CELLOBIOSE
UND
DER
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
.75
4.1.
MOLEKULARGEWICHT
UND
ISOELEKTRISCHER
PUNKT
.
75
4.2.
ABHAENGIGKEIT
DER
GEREINIGTEN
PHOSPHORYLASEN
VON
DER
PHOSPHATKONZENTRATION,
DER
TEMPERATUR
UND
DEM
PH-WERT
.
75
4.3.
TEMPERATUR
UND
CHEMOSTABILITAET
.
79
4.4.
AFFINITAET
DER
GEREINIGTEN
PHOSPHORYLASEN
ZU
IHREN
SUBSTRATEN
.
81
4.5.
ABSORPTIONSSPEKTREN
DER
GEREINIGEN
PHOSPHORYLASEN
.
86
4.6.
BESTIMMUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZEN
.
86
5.
KLONIERUNG
DES
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE-GENS
CEPA
AUS
C.
STERCORARIUM.
.88
5.1.
AUSWAHL
VON
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
88
5.2.
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNGEN
MIT
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
89
5.3.
AMPLIFIKATION
DES
5'-ENDES
VON
CEPA
.
89
5.4.
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNGEN
MIT
4-FACH
DEGENERIERTEM
OLIGONUKLEOTID
.
90
5.5.
KLONIERUNG
VON
AUSGEWAEHLTEN
CHROMOSOMALEN
FRAGMENTSCHAREN
.
91
5.6.
CHROMOSOMALE
KLONIERUNG
DES
3
'-ENDES
VON
CEPA
.
92
5.7.
CHROMOSOMALE
KLONIERUNG
DES
5'-ENDES
VON
CEPA
.
95
5.8.
SEQUENZIERUNG
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
.
97
6.
REKOMBINANTE
EXPRESSION
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
IN
E.
COLI
.99
6.1.
AMPLIFIKATION
UND
KLONIERUNG
DES
CEPA-GENS
IN
E.
COLI
.
99
6.2.
EXPRESSION
DER
CELLOBIOSE-PHOSPHORYLASE
IN
E.
COLI
XL-1
BLUE
.
99
7.
KLONIERUNG
DES
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE-GENS
CEPB
.
101
7.1.
AUSWAHL
VON
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
101
7.2.
AMPLIFIKATION
DES
5'-ENDES
VON
CEPB
.
101
7.3.
AMPLIFIKATION
UND
SEQUENZIERUNG
EINES
1,8
KB-FRAGMENTS
IM
SEQUENZBEREICH
VON
CEPB
.
103
7.4.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
3'-ENDES
VON
CEPB
.104
V
8.
ANALYSE
DER
SEQUENZDATEN
VON
CEPA,
CEPB
UND
ORFX.
.
.108
8.1.
OFFENE
LESERAHMEN
UND
RIBOSOMALE
BINDUNGSSTELLEN
.
108
8.2.
TRANSKRIPTIONSSIGNALE:
PROMOTOREN
UND
TERMINATOREN
.
110
8.3.
DER
GC-GEHALT
CODIERENDER
UND
NICHT
CODIERENDER
REGIONEN
.
111
8.4.
KODONGEBRAUCH
.
113
8.5.
DIE
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG
.
113
D.
DISKUSSION
_
115
1.
TRANSKRIPTIONSEINHEIT
DER
GENE
CELY
UND
CELZ
.115
2.
STRUKTUR
DER
GENE
CEPA
UND
CEPB
.118
3.
REINIGUNG
DER
PHOSPHOROLYTISCHEN
ENZYME
AUS
C.
STERCORARIUM.A23
4.
VERGLEICH
DER
BIOCHEMISCHEN
EIGENSCHAFTEN
VON
CEPA
UND
CEPB
.124
5.
DIE
STELLUNG
DER
CELLOBIOSE
UND
DER
CELLODEXTRIN-PHOSPHORYLASE
AUS
C.
STERCORARIUM
IM
STOFFWECHSEL
.
_
.128
E.
ZUSAMMENFASSUNG
_
131
F.
LITERATURVERZEICHNIS
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132
G.
ANHANG
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