Zur Translationskontrolle der mRNA des keimzellspezifischen Gens für Transitionsprotein 2: Untersuchungen zu RNA-Protein-Interaktionen im 3'UTR der mRNA
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VII
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
5
2.1
CHEMIKALIEN
5
2.2
GEBRAUCHSWAREN
8
23
STAMMLOESUNGEN
8
2.4
STERILISATION
10
23
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
11
2.6
ART
UND HERKUNFT
DES
VERWENDETEN
BIOLOGISCHEN
UND
MOLEKULAR
BIOLOGISCHEN
PROBENMATERIALS
11
2.6.1
ANTIKOERPER
11
2.6.2
BAKTERIENSTAEMME
12
2.6.3
CDNA-EXPRESSIONSBIBLIOTHEK
12
2.6.4
DNA-SONDEN
12
2.6.5
MAEUSE-UND
RATTENSTAEMME
12
2.6.6
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
13
2.6.7
VEKTOREN
13
2.6.8
EUKARYOTISCHE
ZELLINIEN
13
2.7
ISOLIERUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
14
2.7.1
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
GEWEBE
14
2.7.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
14
2.7.3
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
15
2.7.4
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
16
2.7.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
17
2.8
GELELEKTROPHORESE VON
NUKLEINSAEUREN
18
2.8.1
HORIZONTALE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
18
2.8.2
VERTIKALE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
19
N
_
INHALTSVERZEICHNIS
2.8.3
DENATURIERENDE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
19
2.8.4
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
"PAGE"
20
2.8.5
SEQUENZIERUNGS-GELELEKTROPHORESE
20
2.9
ENZYMATISCHE
MODIFIKATIONEN
VON
NUKLEINSAEUREN
21
2.9.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
21
2.9.2
AUFFUELLREAKTION
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
MIT
5'UEBERHAENGENDEN
ENDEN
22
2.9.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
22
2.9.4
RADIOAKTIVE
"RANDOM
PRIMER"-MARKIERUNG
VON
DNA
22
2.9.5
RADIOAKTIVE
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
VON
RNA
23
2.10
ISOLIERUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREFRAGMENTEN
24
2.10.1
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
24
2.10.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
25
2.10.3
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
25
2.10.4
AUFREINIGUNG
VON
IN
VITRO-TRANSKRIPTEN
26
2.10.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
IN
VITRO-TRANSKRIBIERTER
RNA
27
2.11
"PCR"-TECHNIKEN
(POLYMERASE-KETTEN-REAKTION)
27
2.11.1
PCR
AN
GENOMISCHER
UND
PLASMID-DNA
27
2.11.2
PCR
AN
EINER
PHAGEN-CDNA-EXPRESSIONSBIBLIOTHEK
28
2.11.3
IN
VITRO-MUTAGENESE
UEBER
PCR
29
2.11.4
HERSTELLUNG
VON
ZIELSEQUENZEN
FUER
DIE
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
UEBER
PCR
30
2.12
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
30
2.12.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
30
2.12.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
31
2.13
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
31
2.13.1
35
S-SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
32
2.13.2
35
S-SEQUENZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
32
2.13.3
NICHTRADIOAKTIVES
"DYE
TERMINATOR
CYCLE
SEQUENCING"
33
INHALTSVERZEICHNIS
_
M
2.14
ISOLIERUNG
REKOMBINANTER
KLONE
AUS
EINER
PHAGEN-CDNA-EXPRESSIONS
35
BIBLIOTHEK
2.14.1
AUSPLATTIEREN
DER
CDNA-BIBLIOTHEK
UND
INDUKTION
DER
EXPRESSION
35
2.14.2
TRANSFER
DER
FUSIONSPROTEINE
AUF
NITROZELLULOSEFOLIE
35
2.14.3
ANREICHERUNG
UND
ISOLIERUNG
VON
PHAGENKLONEN
36
2.15
ZELLKULTUR
ETABLIERTER
EUKARYOTISCHER
ZELLINIEN
36
2.16
ISOLIERUNG
VON
KEIMZELLEN
AUS
TESTISGEWEBE
37
2.17
EXTRAKTION
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
39
2.17.1
ISOLIERUNG
VON
KEMPROTEINEN
39
2.17.2
ISOLIERUNG
VON
ZYTOPLASMATISCHEN
S
100-PROTEINEXTRAKTEN
41
2.17.3
SELEKTIVE
ANREICHERUNG
VON
PROTEINEN
UEBER
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
42
2.17.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
43
ZIS
"ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY"
(EMSA,
BANDSHIFT)
43
2.18.1
RNA/PROTEIN-BINDUNGSREAKTION
44
2.18.2
NICHTDENATURIERENDE
AUFTRENNUNG
VON
RNA/PROTEIN-KOMPLEXEN
44
2.18.3
"CROSSLINKING"
VON
RNA/PROTEIN-KOMPLEXEN
45
Z19
GELELEKTROPHORESE VON
PROTEINEN
46
2.19.1
DENATURIERENDE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
46
2.19.2
HOCHAUFLOESENDE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
IN
INVERSEN
47
STUFENGELEN
2.20
UEBERTRAGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
AUF
MEMBRANE
("BLOTTING")
48
2.20.1
"SOUTHERN
BLOTTING"
VON
DNA
48
2.20.2
"NORTHERN
BLOTTING"
VON
RNA
49
2.20.3
"WESTERN
BLOTTING"
VON
PROTEINEN
49
2.20.4
"NORTHWESTERN
BLOTTING"
50
2Z1
NACHWEIS
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
50
2.21.1
ETHIDIUMBROMIDFARBUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
IN
GELEN
50
2.21.2
METHYLENBLAUFAERBUNG
VON
RNA
AUF
NITROZELLULOSEFOLIE
51
2.21.3
HYBRIDISIERUNG
32
P-MARKIERTER
SONDEN
AUF
NUKLEINSAEUREN
51
IY----------------------------------------------------------------------------------------
INHALTSVERZEICHNIS
2.21.4
COOMASSIEFAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
52
2.21.5
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEIN
UND
RNA-GELEN
52
2.21.6
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
NACH
"WESTERN
BLOTTING"
53
2.21.7
SONDIERUNG
VON
PROTEINEN
MIT
32
P-MARKIERTER
RNA
IM
"NORTHWESTERN"
54
EXPERIMENT
2.22
EDV-ANALYSEMETHODEN
55
2.22.1
BEARBEITUNG
UND
ANALYSE
VON
DNA-SEQUENZDATEN
55
2.22.2
RNA-STRUKTURANALYSE
55
3.
ERGEBNISSE
56
3.1
DARSTELLUNG
DER
VERWENDETETEN
TRANSKRIPTE
DER
TNP2-3'UTRS
ZUR
ANALYSE
56
VON
RNA/PROTEIN-INTERAKTIONEN
3.2
"ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY"
-
ANALYSE
VON
RNA/-PROTEIN-INTER
60
AKTIONEN
IM
3'NICHTTRANSLATIERTEN
BEREICH
DER
TNP2-MRNA
3.2.1
DAS
IN
VITRO-TRANSKRIPT
DER
TNP2-3'UTR
DER
RATTE
BILDET
MIT
ZYTOPLAS
63
MATISCHEN
PROTEINEN
AUS
ADULTEM
RATTENHODEN
SPEZIFISCHE
RNA/PROTEIN
KOMPLEXE
3.2.2
KEIMZELLSPEZIFITAET
DER
KOMPLEXBILDENDEN
PROTEINE
65
3.2.3
SPEZIFITAET
DER
KOMPLEXBILDUNG
68
3.2.4
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
VON
AN
DER
KOMPLEXBILDUNG
BETEILIGTEN
71
PROTEINEN
NACH
UV-"CROSSLINKING"
UND
RNASE-VERDAU
3.2.5
ANREICHERUNG
UND
FRAKTIONIERUNG
VON
RNA-BINDENDEN
PROTEINEN
DURCH
74
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
3.2.6
EINFLUSS
DES
KONSERVIERTEN
8
BP-MOTIVS
AUF
DIE
FAEHIGKEIT
VON
IN
VITRO
76
TRANSKRIPTEN
DER
RTNP2-3'UTR
RNA/PROTEIN-KOMPLEXE
AUSZUBILDEN
3.2.7
EINFLUSS
VON
SEQUENZVERAENDERUNGEN
IM
KONSERVIERTEN
8
BP-MOTIV
AUF
DIE
78
FAEHIGKEIT
VON
IN
VITRO-TRANSKRIPTEN
DER
RTNP2-3'UTR
RNA/PROTEIN
KOMPLEXE
AUSZUBILDEN
INHALTSVERZEICHNIS
V
33
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN,
DIE
MIT
M
VIFRO-TRANSKRIPTEN
DER
TNP2
81
3
'
UTR
INTERAGIEREN
3.3.1
EINFLUSS
DES
8
BP-MOTIVS
AUF
DIE
FAEHIGKEIT
DER
RNA
DER
TNP2-3'UTR
81
MIT
IMMOBILISIERTEN
PROTEINEN
ZU
INTERAGIEREN
33.2
EINFLUSS
DES
8
BP-MOTIVS
AUF
DIE
INTERAKTION
DER
RNA
DER
RTNP2
83
3'UTR
MIT
EINEM
47
KDA-PROTEIN
3.33
EINFLUSS
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
DER
RNA
DER
TNP2-3'UTR
AUF
DIE
85
BINDUNG
MIT
DEM
PROTEIN
P47
3.3.4
ENTWICKLUNGS
UND
KEIMZELLSPEZIFISCHE
AKTIVITAET
DER
PROTEINE
P45,
88
P47
UND
P49
3.4
RNA-STRUKTURANALYSE
IN
DER
3'UTR
DER
TNP2-MRNA
90
33
ERGEBNIS
DER
IMMUNODETEKTION
MIT
DEM
XENOPUS
P54/P56-ANTIKOERPER
95
3.6
ISOLIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
FUER
RNA-BINDENDE
PROTEINE
AUS
EINER
96
XGTLL-CDNA-EXPRESSIONSBIBLIOTHEK
3.6.1
ISOLIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
FUER
AN
DIE
RNA
DER
RTNP2-3'UTR
97
BINDENDE
FUSIONSPROTEINE
3.6.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GEWEBSSPEZIFISCHEN
EXPRESSION
DER
RTNP2-BP
98
CDNA-KLONE
3.6.3
KEIMZELLSPEZIFISCHE
EXPRESSION
DER
MIT
RTNP2-BP-CDNA-KLONEN
100
IDENTIFIZIERTEN
TRANSKRIPTE
3.6.4
SEQUENZANALYSE
DER
KEIMZELLSPEZIFISCHEN
RTNP2-BP-CDNA-KLONE
103
UND
DATENABGLEICH
MIT
DER
EMBL/GENBANK
4.
DISKUSSION
106
4.1
IN
VOERO-TRANSKRIPTE
DER
TNP2-3'UTR
DER
RATTE
BILDEN
MIT
ZYTOPLASMA
107
TISCHEN
PROTEINEN
AUS
RATTENTESTIS
SPEZIFISCHE
RNA/PROTEINKOMPLEXE
4.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN,
DIE
MIT
IN
VIFRO-TRANSKRIPTEN
DER
TNP2
114
3'UTR
INTERAGIEREN
43
DIE SPEZIFISCHE
BINDUNG
EINES
KEIMZELLSPEZIFISCHEN
PROTEINS
P47
IST
117
STRUKTURABHAENGIG
VI
_
INHALTSVERZEICHNIS
4.4
STABILISIERT
EIN
MULTIPROTEINKOMPLEX
DIE
SEKUNDAERSTRUKTUR
DER
MRNA
122
DER
TNP2-3UTR?
4.5
MOEGLICHE
FUNKTION
VON
P47
IM
MECHANISMUS
DER
NEGATIVEN
TRANSLATIONS
127
KONTROLLE
DER
TNP2-MRNA
4.6
CHARAKTERISIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
POTENTIELLER
BINDUNGSPROTEINE
FUER
129
DIE
MRNA
DER
TNP2-3'UTR
DER
RATTE
4.7
AUSBLICK
131
5.
ZUSAMMENFASSUNG
132
6.
LITERATURVERZEICHNIS
134 |
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