Untersuchungen zur morphologischen und molekularbiologischen Charakterisierung der Gräserendophyten Acremonium lolii und A. uncinatum und deren Auswirkungen auf ihren Wirt:
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1996
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| Beschreibung: | Paderborn, Univ. Gesamthochsch., Diss., 1996 |
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Titel: Untersuchungen zur morphologischen und molekularbiologischen Charakterisierung der Gräserendophyten
Autor: Dapprich, Peter
Jahr: 1996
1 EINLEITUNG 1
1.1 Bedeutung der Gräserendophyten 1
1.2 Gräserendophyten 6
1.1.1 Nachweis der Gräserendophyten 10
1.3 Alkaloide als Ursache für die endophytinduzierten Auswirkungen auf ihre Wirte 13
1.3.1 Peramin 13
1.3.2 Lolin-Alkaloide 14
1.3.3 Ergot-Alkaloide 16
1.3.4 Paxillin und Lolitreme 18
1.3.5 Perlolin 20
1.4 Problemstellung 22
2 MATERIAL UND METHODEN 24
2.1 Herkunft und Bezeichnung der Acremonium-IstAate 24
2.2 Herkunft und Bezeichnung der Versuchspflanzen der Gattungen Lolium
und Festuca 25
2.2.1 Freilandproben von Dauergrünland aus den Raum Duisburg (NRW) 26
2.2.2 Lolium perenne-PiX eA auf den Gesamtflächen 26
2.2.3 Untersuchung des Probenmaterials 27
2.3 Nachweis von Acremonium in Karyopsen und Pflanzen von Lolium und Festuca 27
2.3.1 Mikroskopische Färbenachweise von Acremonium 27
2.3.1.1 Anilinblau-Färbung von Karyopsen 28
2.3.1.2 Fluoreszein-diacetat (FDA)-Färbung von Karyopsen 28
2.3.1.3 Nachweis von Endophyten in Blattscheiden von Gräsern mit Anilmblau 29
2.3.1.4 Nachweis vitaler Endophyten in Blattscheiden von Gräsern mit FDA 29
2.3.2 Nachweis durch direkte Isolierung der Endophyten aus Karyopsen und
Pflanzenteilen 30
2.3.2.1 Isolierung aus Saatgut 30
2.3.2.2 Isolierung aus Pflanzen 30
2.3.2.3 Weiterentwicklung der Isolierungsmethode aus Pflanzen 30
2.3.3 Einfluß fester Nährmedien bei der Isolierung von Endophyten aus Pflanzen 31
2.4 In vilro-Kultur von Acremonium und Epichloe typhina 31
2.4.1 Agarkultur und Vermehrung 31
2.4.2 Kultur und Vermehrung in Flüssignährmedien 32
2.5 Identifizierung von endophytischen Pilzen der Gattung Acremonium 32
2.5.1 Untersuchungen zur Sporulation von Acremonium und Epichloe' typhina 33
2.6 Sammlung von Acremonium-Uoltten unterschiedlicher Herkiinfte 34
2.7 Erhaltung von Acremonium unterschiedlicher Herkunft in vitro und in vivo 34
2.7.1 Erhaltung und Lebensdauer in vitro 34
2.7.2 Erhaltung von Acremonium in vivo 35
2.8 Besiedlung der Wirtspflanze in Abhängigkeit von der Temperatur 35
2.9 Erste Untersuchungen zum Verhalten von A(+) und A(-)-Kionen von
L. perenne bei verschiedenen Umweltbedingungen im Gewächshaus 36
2.9.1 Beobachtungen zur Trockenstress-Toleranz von A(+)-Gräsem 36
2.9.2 Untersuchungen zum Biomasseertrag und Alkaloidgehalt bei
unterschiedlicher Stickstoflversorgung 37
2.9.2.1 Versuchspflanzen 37
2.9.2.2 Versuchsanordnung 37
2.9.2.3 Versuchsdurchführung 38
2.10 Herstellung von endophytfreien Gräsern für vergleichende Untersuchungen 38
2.10.1 Wärmebehandlung von A(+)-Gräsern 3 8
2.10.2 Fungizidbehandlung 39
2.11 Versuche zur Inokulation von L. perenne mit Acremonium 40
2.11.1 Inokulation durch Insertion von Myzel unter sterilen Bedingungen 40
2.11.1.1 Anzucht der Versuchspflanzen 40
2.11.1.2 Myzelvermehrung 40
2.11.1.3 Inokulation 40
2.11.2 Inokulation durch nicht sterile Injektion von Myzel bzw. Sporensuspension 41
2.11.2.1 Pflanzenvorbereitung 41
2.11.2.2 Inokulum 41
2.11.2.3 Injektion des Endophytenmaterials 41
2.11.3 Inokulation durch nicht sterile Insertion von Myzel in adulte Pflanzen 42
2.11.4 Inokulation durch Cokultivation 42
2.11.4.1 Auf festem Nährmedium 42
2.11.4.2 Auf semi-festem Nährmedium 43
2.11.4.3 In Flüssigmedium 44
2.11.4.4 Immobilisierung in Alginat 44
2.12 Proteinanalysen 44
2.12.1 Pilzmyzel 44
2.12.2 Extraktherstellung 45
2.12.3 Proteinreinigung und -konzentration 45
2.12.3.1 Quantifizierung der Proteinextrakte 45
2.12.3.2 Optimierung der Proteinextraktion 45
2.12.4 Elektrophorese 46
2.12.5 Proteinnachweis 48
2.12.5.1 Gesamtnachweis der Proteine 48
2.12.5.2 Isoenzymfärbungen 49
2.12.6 Dokumentation der Gele 50
2.13 Erste Untersuchungen zum Nachweis spezifischer Alkaloiden in der
Loäum I Acremonium- bzw. Festuca I Acremonium-Symbiost 51
2.13.1 A(+) und A(-)-Gräser für die Alkaloidextraktion 51
2.13.2 Extraktionsverfahren 51
2.13.3 Nachweis spezifischer Alkaloide mit der TLC 53
2.13.3.1 Isolierung von Alkaloiden aus der TLC-Matrix 54
2.14 Nachweis spezifischer Alkaloide mit der HPLC 54
3 ERGEBNISSE 56
3.1 Nachweis von Acremonium in Saatgut und Gräsern 56
3.1.1 Unspezifischer Nachweis von Gräserendophyten in der Karyopse und in
Pflanzen 56
3.1.2 Unspezifischer Nachweis von vitalem Acremonium in Pflanzen 59
3.1.3 Unspezifischer Nachweis von vitalem Acremonium in der Karyopse 61
3.1.4 Vitalitätsnachweis durch Isolierung von Acremonium aus der Karyopse 61
3.2 Weiterentwicklung der Isolierungsmethode von Acremonium aus Pflanzen 63
3.3 Bestimmung von Acremonium 65
3.3.1 Morphologie/« vitro 65
3.3.2 Sporulationvon^crawo/Kww 68
3.4 Sammlung von Acremonium unterschiedlicher Herkünfte und
Gräserspezies 71
3.5 Kulturbedingungen von Acremonium auf festen Nährmedien 73
3.6 Besiedlung und Ausbreitung von Acremonium in Gräsern 74
3.7 Beobachtungen zur Biologie von A(+) und A(-)-Klonen im Gewächshaus 74
3.7.1 Einfluß von Trockenstressaufdie;lcra»o«/«/»/ Wirtsgras-Symbiose 74
3.7.2 Untersuchungen zum Biomasseertrag bei unterschiedlichen
Stickstoffdüngungen 75
3.8 Herstellung von A(-)-Pflanzen für vergleichende Untersuchungen 76
3.8.1 Wärmebehandlung 76
3.8.2 Fungizidbehandlung 77
3.9 Versuche zur Inokulation von Gräsern mit Acremonium 77
3.9.1 Inokulation durch direktes Einbringen von Acremonium in die Pflanze 77
3.9.1.1 Insertion von Myzel 77
3.9.1.1.1 Myzelinsertion in Sämlinge in vitro 77
3.9.1.1.2 Myzelinsertion in Jungpflanzenklone in vivo 78
3.9.1.2 Injektion von Myzel-bzw. Sporensuspension 78
3.9.2 Inokulation durch Cokultivation 79
3.9.2.1 Auf festen Nährmedien 79
3.9.2.2 Aufsemi-solid Agar 80
3.9.2.3 In flüssigen Nährmedien 80
3.9.2.4 Durch Alginatimmobilisierung 80
3.10 Bestimmung von Acremonium mit molekularbiologischen Methoden 82
3.10.1 Quantifizierung von Protein-Rohextrakten 82
3.10.2 Identifizierung von Acremonium durch Proteinanalysen 84
3.10.2.1 a-Esterasen (syn. Pektinesterasen) 86
3.10.2.2 Saure Phosphatase (ACP) 88
3.10.2.3 Cytochrom b5-Reduktase (syn. NAD-Diaphorase) (DIA) 88
3.10.3 Untersuchung der Sekundärmetabolite der Gtas/Acrcemonium-Symbiose 92
3.10.3.1 Identifizierung spezifischer Alkaloide der GraslAcremonium-
Symbiose mit Hilfe der TLC 92
3.10.4 Einfluß der Stickstoffdüngung auf den Gehalt an Lolitrem B in der
Trockensubstanz von L. perenne A(+) und A(-)-Pflanzen unter
Gewächshausbedingungen 97
3.11 Untersuchung von L. perenne Freilandproben auf das Vorhandensein des
Nerotoiins Lolitrem B 99
4 DISKUSSION 101
4.1 Nachweis und Biologie von Acrenumium 101
4.2 Bestimmung von Acremonium in vitro 105
4.2.1 In vitro Morphologie zur Artunterscheidung von Acremonium 106
4.2.2 Sporulation als Artbestimmungsmerkmal 107
4.3 Beobachtungen zu Auswirkungen von Acremonium auf das Wirtsgras 108
4.4 Herstellung von Acremonium-freien Pflanzen 111
4.5 Inokulationsversuche 112
4.6 Molekularbiologische Untersuchungen von Acremonium 114
4.7 Alkaloid-Nachweis mit TLC und HPLC 119
4.7.1 Freilandproben 122
5 ZUSAMMENFASSUNG 124
6 AUSBLICK 127
7 LITERATURVERZEICHNIS 129
8 ANHANG 146 |
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