Untersuchungen zur Wirkung des Shiga-like-Toxins-I (SLT-I) von Escherichia coli auf Immunzellen des Rindes:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
LITERATURUEBERSICHT
.
2
2.1.
DIE
SHIGA-TOXIN-/SHIGA-LIKE-TOXIN-FAMILIE
.
4
2.1.1.
GENETIK
.
5
2.1.2.
BIOLOGISCHE
UND
PHYSIKALISCHE
EIGENSCHAFTEN
.
7
2.1.3.
STRUKTUR
.
8
2.2.
REZEPTORSTRUKTUREN
UND
DEREN
ERKENNUNG
DURCH
DIE
SHIGA-LIKE-TOXINE
.
14
2.2.1.
STRUKTUR
UND
SYNTHESE
DER
FUNKTIONELLEN
REZEPTOREN
.
15
2.2.2.
REGULATION
DER
REZEPTOREXPRESSION
AUF
ZELLEN
.
15
2.2.3.
ZUSAMMENHANG
ZWISCHEN
DER
REZEPTOREXPRESSION
UND
DER
EMPFINDLICHKEIT
VON
ZELLEN
GEGENUEBER
DER
ZYTOTOXISCHEN
WIRKUNG
DER
SHIGA-LIKE-TOXINE
.
17
2.2.4.
TOXIN-REZEPTOR-BINDUNG
.
18
2.2.4.1.
KINETIK
DER
TOXIN-REZEPTOR-BINDUNG
.
18
2.2.4.2.
AN
DER
REZEPTORERKENNUNG
BETEILIGTE
STRUKTUREN
AUF
SEITEN
DER
REZEPTOREN
.
19
2.2.4.3.
DIE
REZEPTORBINDUNGSDOMAENE
DER
TOXINE
.
22
2.2.4.4.
MULTIVALENZ
DER
TOXINBINDUNG
.
23
2.3.
WIRKUNG
VON
SHIGA-TOXIN-/SHIGA-LIKE-TOXIN
AUF
ZELLEN
.
24
2.3.1.
ENTWICKLUNG
DER
ZYTOTOXISCHEN
AKTIVITAET
.
26
2.3.1.1.
REZEPTOR-VERMITTELTE
ENDOZYTOSE
.
26
2.3.1.2.
PROZESSIERUNG
DER
TOXINE
IN
DER
ZIELZELLE
.
28
2.3.1.3.
TRANSLOKATION
DER
A-UNTEREINHEIT
IN
DAS
ZYTOSOL
.
28
2.3.1.4.
ENZYMATISCHE
AKTIVITAET
DER
TOXINE
.
29
2.3.1.5.
AUSWIRKUNGEN
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
DER
TOXINE
AUF
EINZELZELLEN
.
32
2.3.2.
DIREKTE
AUSLOESUNG
VON
APOPTOSE
.
34
2.4.
ZIELZELLEN
FUER
SHIGA-LIKE-TOXINE
.
37
2.4.1.
DARMEPITHELZELLEN
.
37
2.4.2.
MAKROPHAGEN
.
39
2.4.3.
ENDOTHELZELLEN
.
41
2.4.4.
NERVENZELLEN
.
49
2.4.5.
IMMUNZELLEN
.
50
INHALTSVERZEICHNIS
3.
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
.
57
3.1.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
57
3.1.1.
GEWINNUNG
VON
SHIGA-LIKE-TOXINEN
.
57
3.1.1.1.
ANZUCHT
DER
BAKTERIEN
.
57
3.1.1.2.
GEWINNUNG
VON
ROHTOXIN
.
58
3.1.2.
PROTEINAUFREINIGUNG
.
58
3.1.2.1.
AUFREINIGUNG
VON
SLT-1
.
58
3.1.2.1.1.
FARBSTOFF-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
58
3.1.2.1.2.
IMMUNO-AFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
59
3.1.2.1.3.
ENTFERNUNG
VON
ENDOTOXIN
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
ENDOTOXINGEHALTES
.
60
3.1.2.1.4.
PROTEINBESTIMMUNG
.
61
3.1.2.1.5.
SDS-POLYAKRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
61
3.1.2.2.
AUFREINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
62
3.1.2.2.1.
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
62
3.1.2.2.2.
QUALITATIVER
UND
QUANTITATIVER
NACHWEIS
VON
MURINEM
IMMUNGLOBULIN
G
.
63
3.1.3.
ZELLKULTURMETHODEN
.
64
3.1.3.1.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
.
64
3.1.3.1.1.
VERWENDETE
ZELLINIEN
.
64
3.1.3.1.2.
KULTIVIERUNG
ADHAERENTER
ZELLINIEN
.
65
3.1.3.1.3.
KULTIVIERUNG
NICHT-ADHAERENTER
ZELLINIEN
.
67
3.1.3.1.4.
KULTIVIERUNG
VON
HYBRIDOMZELLEN
UND
MASSENPRODUKTION
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
67
3.1.3.2.
PRAEPARATION
UND
KULTIVIERUNG
BOVINER
MONONUKLEAERER
ZELLEN
DES
PERIPHEREN
BLUTES
(PBMC)
.
67
3.1.3.3.
PRAEPARATION
UND
KULTIVIERUNG
MONOZYTEN-ANGEREICHERTER
UND
-REDUZIERTER
KULTUREN
.
68
3.1.3.4.
ZELLKULTURTEST
ZUM
NACHWEIS
DER
WIRKUNG
VON
SHIGA-LIKE
TOXINEN
AUF
ZELLEN
.
69
3.1.3.5.
ZELLKULTURTEST
ZUM
NACHWEIS
VON
BOVINEM
TUMOR-NEKROSE
FAKTOR-ALPHA
(BOTNF-A)
UND
TITRATION
VON
BOTNF-A
NEUTRALISIERENDEM
KANINCHENSERUM
.
70
3.1.3.6.
AUSWERTUNG
DER
ZELLKULTURTESTS
.
71
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.4.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
72
3.1.4.1.
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DIE
ZWEIFARBENFLUORESZENZ
.
73
3.1.4.2.
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DIE
DREIFARBENFLUORESZENZ
.
73
3.1.4.3.
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DEN
NACHWEIS
VON
DNA-STRANGBRUECHEN
IN
EINZELZELLEN
.
74
3.1.4.4.
PROBENANALYSE
.
76
3.1.5.
GENETISCHER
NACHWEIS
VON
SLTEC
IN
KOTPROBEN
.
76
3.1.6.
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
.
76
3.2.
ERGEBNISSE
.
78
3.2.1.
VORARBEITEN
.
78
3.2.1.1.
GEWINNUNG
VON
SHIGA-LIKE-TOXINEN
.
78
3.2.1.2.
AUFREINIGUNG
VON
SLT-1
.
79
3.2.1.2.1.
FARBSTOFF-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
79
3.2.1.2.2.
IMMUNO-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
79
3.2.1.2.3.
ENTFERNUNG
VON
ENDOTOXIN
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
ENDOTOXINGEHALTES
.
87
3.2.1.3.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
VON
BOVINEN
LEUKOZYTEN
UND
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
.
87
3.2.1.4.
BIOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
BOTNF-A
IM
PK(15)-ZELLTEST
.
98
3.2.2.
WIRKUNG
VON
SLT-I
AUF
ADHAERENTE
ZELLINIEN
VERSCHIEDENER
SPEZIES
.
98
3.2.3.
~
WIRKUNG
VON
SLT-I
AUF
HUMANE
UND
BOVINE
B-LYMPHOM-ZELLINIEN
.
103
3.2.3.1.
HUMANE
DAUDIZELLEN
.
103
3.2.3.2.
BOVINE
BL-3-ZELLEN
.
105
3.2.3.2.1.
WIRKUNG
AUF
DIE
VITALITAET
VON
BL-3-ZELLEN
.
105
3.2.3.2.2.
EXPRESSION
VON
CD77
AUF
BL-3-ZELLEN
.
108
3.2.3.2.3.
EXPRESSION
VON
BOVINEN
LEUKOZYTENOBERFLAECHEN
ANTIGENEN
AUF
BL-3-ZELLEN
.
108
3.2.3.2.4.
APOPTOSE
IN
BL-3-ZELLEN
.
112
3.2.4.
WIRKUNG
VON
BAKTERIENLYSATEN
BOVINER
SLTEC-STAEMME
AUF
DIE
STOFFWECHSELAKTIVITAET
BOVINER
PBMC
.
117
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.5.
WIRKUNG
VON
SLT-I
AUF
BOVINE
PBMC
.
122
3.2.5.1.
WIRKUNG
VON
SLT-I
AUF
DIE
STOFFWECHSELAKTIVITAET
UND
DIE
MITOGENE
STIMULIERBARKEIT
VON
BOVINEN
PBMC
.
123
3.2.5.1.1.
VERSUCHE
MIT
PBMC-KULTUREN
IN
ZELLKULTURMEDIUM
1
.
123
3.2.5.1.2.
EINFLUSS
DER
VERSUCHSBEDINGUNGEN
.
128
3.2.5.1.3.
VERSUCHE
MIT
PBMC-KULTUREN
IN
ZELLKULTURMEDIUM
2
.
133
3.2.5.2.
WIRKUNG
VON
SLT-I
AUF
DIE
EINZELNEN
LYMPHOZYTEN
SUBPOPULATIONEN
BOVINER
PBMC
.
142
3.2.5.3.
BEEINFLUSSUNG
DER
CD77-EXPRESSION
AUF
BOVINEN
PBMC
DURCH
SLT-I
.
161
3.2.5.4.
BEDEUTUNG
DER
MONOZYTEN
FUER
DIE
WIRKUNG
VON
SLT-I
AUF
BOVINE
PBMC
UND
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
BOTNF-A
UND
SLT-I
.
179
3.2.5.5.
APOPTOSE
IN
BOVINEN
PBMC
.
180
4.
BESPRECHUNG
DER
ERGEBNISSE
.
184
5.
ZUSAMMENFASSUNG
/
SUMMARY
.
194
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
198
7.
ANHANG:
VERWENDETE
MATERIALIEN
.
216
7.1.
VERWENDETE
REAGENZIEN
.
216
7.2.
VERWENDETE
PUFFER
UND
MEDIEN
.
218
7.3.
HERSTELLUNG
DER
PUFFER
UND
MEDIEN
.
223 |
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