Molekulare Charakterisierung der Ornithin-Decarboxylase des Nematoden Panagrellus redivivus (Linné, 1767):
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1996
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INHALT
1
EINLEITUNG
1
1.1
NEMATODA
1
1.1.1
FREILEBENDE
NEMATODEN
2
1.1.2
PARASITISCHE
NEMATODEN
3
1.1.3
VERGLEICH
VON
P.
REDIVIVUS
MIT
C.
ELEGANS
UND
A.
SUUM
5
1.2
POLYAMINE
6
1.2.1
POLYAMINSTOFFWECHSEL
7
1.2.1.1
BIOSYNTHESE
UND
INTERKONVERSION
DER
POLYAMINE
7
1.2.1.2
REGULATION
DER
POLYAMINBIOSYNTHESE
10
1.2.1.3
TERMINALER
KATABOLISMUS
DER
POLYAMINE
12
1.2.1.4
POLYAMINSTOFFWECHSEL
VON
NEMATODEN
12
1.2.2
FUNKTION
DER
POLYAMINE
13
1.3
ZIELSETZUNG
15
2
MATERIAL
UND
METHODEN
16
2.1
CHEMIKALIEN,
BIOREAGENZIEN
UND
MEDIEN
16
2.2
NEMATODENMATERIAL
20
2.2.1
PANAGRELLUS
REDIVIVUS
20
2.2.2
CAENORHABDITIS
ELEGANS
20
2.2.3
ONCHOCERCA
VOLVULUS
21
2.2.4
ASCARIS
SUUM
21
2.3
ANDERES
MATERIAL
21
2.4
VEKTOREN,
BAKTERIEN
UND
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
22
2.4.1
PHAGENVEKTOREN
22
2.4.2
PLASMIDVEKTOREN
22
2.4.3
WIRTSBAKTERIEN
22
2.4.4
EUKARYONTISCHE
WIRTSZELLEN
22
2.5
PRAEPARATION
VON
DNA
22
2.5.1
MINI-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
22
2.5.2
GROSS-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
23
2.5.3
GENOMISEHE
DNA
23
2.5.3.1
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
VON
P.
REDIVIVUS,
C.
ELEGANS
UND
A.
SUUM
24
2.6
ETHANOLFAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
24
2.7
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
VON NUKLEINSAEUREN
24
2.8
PRAEPARATION
VON
RNA
24
2.8.1
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
P.
REDIVIVUS
24
2.8.2
ISOLIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
AUS
P.
REDIVIVUS
25
2.9
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
25
2.10
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNA
25
2.11
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
26
2.12
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
26
2.13
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
26
2.14
LIGATION
VON
DNA
27
2.14.1
SUBKLONIERUNG
IN
UNTERSCHIEDLICHE
PLASMID
VEKTOREN
27
2.14.2
SUBKLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
IN
PCRYYII
("TA-CLONING")
27
2.14.3
SUBKLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
IN
SMAL
GESCHNITTENEN
PUC18
27
2.15
TRANSFORMATION
28
2.15.1
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
(DH5
A,
BL21,
EWH331)
28
2.15.2
DURCHFUEHRUNG
DER
TRANSFORMATION
29
2.16
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
29
2.17
TRANSFER
VON
DNA
("SOUTHERN-BLOT")
30
2.18
TRANSFER
VON
RNA
("NORTHERN-BLOT")
30
2.19
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTER
DNA
30
2.20
HYBRIDISIERUNG
VON
RNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTER
DNA
32
2.21
DNA-BIBLIOTHEKEN
IM
PHAGEN
X
32
2.21.1
CDNA
SYNTHESE
UND
KONSTRUKTION
DER
CDNA-
BIBLIOTHEK
VON
P.
REDIVIVUS
33
2.21.2
HERSTELLUNG
DER
BAKTERIENSUSPENSION
FUER
DAS
SICHTEN
DER
DNA-BIBLIOTHEKEN
(P2392,
XLL-BLUE)
33
2.21.3
SICHTEN
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
IM
PHAGEN
X
ZAP
II
33
2.21.4
"IN
VIVO
EXCISION"
VOM
PHAGEN
1
ZAP
II
ZUM
PLASMIDVEKTOR
34
2.21.5
SICHTEN
VON
GENOMISCHEN
BIBLIOTHEKEN
IM
PHAGEN
X
EMBL-3
UND
EMBL-4
34
2.21.6
HERSTELLUNG
VON
PHAGENVORLYSATEN
35
2.21.7
DNA-PRAEPARATION
AUS
PHAGEN
35
2.22
DNA-SEQUENZANALYSE
36
2.22.1
DENATURIERUNG
VON
DNA
FUER
DIE
SEQENZANALYSE
36
2.22.2
SEQUENZIERUNG
36
2.23
"5'-RACE"
("5'-RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS")
36
2.24
ORNITHIN-DECARBOXYLASE-AKTIVITAETSTEST
37
2.25
HERSTELLUNG
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
38
2.25.1
SUBKLONIERUNG
DER
CDNA
DER
ORNITHIN
DECARBOXYLASE
VON
P.
REDIVIWS
IN
DIE
PLASMID
VEKTOREN
PJC20,
PTRCHISB
UND
PBSVSHIS
38
2.25.2
EXPRESSION
DER
CDNA
39
2.25.2.1
EXPRESSION
VON
PTRCHISB:
:
RPODC
IN
BL21
39
2.25.2.2
EXPRESSION
VON PJC20::RPODC
IN
EWH331
39
2.25.2.3
EXPRESSION
VON
PBSV8HIS:
:
RPODC
IN
INSEKTENZELLEN
40
2.25.3
REINIGUNG
DER
RPODC
41
2.25.3.1
REINIGUNG
VON
EXPRESSIONSPRODUKTEN
DER
VEKTOREN
PTRCHISB:
:
RPODC
UND
PBSV8HIS:
:
RPODC
41
2.25.3.2
REINIGUNG VON
EXPRESSIONSPRODUKTEN
DES
VEKTORS
PJC20::RPODC
42
2.26
PROTEINBESTIMMUNG
43
2.27
DISK-ELEKTROPHORESE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
44
2.28
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLANIIDGELEN
45
2.29
CHARAKTERISIERUNG
DER
RPODC
46
2.29.1
GELFILTRATION
ZUR
MOLEKULARGEWICHTS-BESTIMMUNG
DES
RPODC-MONOMERS
46
2.29.2
NACHWEIS
VON
PUTRESCIN
ALS
REAKTIONSPRODUKT
UBER
"REVERSED-PHASE"-HPLC
47
2.29.3
DEMONSTRATION
DER
PLP-ABHAENGIGKEIT
UND
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
PLP-KONZENTRATION
48
2.29.4
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
48
2.29.5
BESTIMMUNG
DES
K
M
-WERTES
49
2.29.6
BESTIMMUNG
DES
KI-WERTES
FUER
A-DIFLUOROMETHYL
ORNITHIN
49
2.29.7
BESTIMMUNG
DER
KI-WERTE
UND
DER
HEMMTYPEN
VON
A-METHYLORNITHIN,
A-HYDRAZINOORNITHIN
UND
PUTRESCIN
49
2.29.8
AUSWERTUNG
DER
ENZYMTESTS
49
2.30
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
50
2.31
PRAEPARATION
DES
100000
X
G
UEBERSTANDES
VON
A.
SUUM,
O.
VOLWLUS,
P.
REDIVIWS,
BOS
SPEC.
(LEBER)
UND
P.
FALCIPARUM
51
2.32
TRANSFER
VON
PROTEINEN
("WESTERN-BLOT")
52
2.33
IMMUNODETEKTION
TRANSFERIERTER
PROTEINE
53
3
ERGEBNISSE
54
3.1
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
MIT
GENOMISCHER
DNA
VON
PANAGRELLUS
REDIVIVUS
54
3.2
"NORTHERN-BLOT"
MIT
GESAMT-RNA
UND
POLY(A)
+
-RNA
VON
P.
REDIVIVUS
57
3.3
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
DER
CDNA
DER
ORNITHIN
DECARBOXYLASE
VON
P.
REDIVIVUS
58
3.3.1
ISOLIERUNG
EINES
VOLLSTAENDIGEN
KLONS
AUS
EINER
CDNA-BANK
58
3.3.2
SEQUENZANALYSE
DER
CDNA
DER
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
58
3.3.3
"5'
-RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS"
ZUR
BESTIMMUNG
DES
TRANSKRIPTIONSSTARTS
DER
MRNA
DER
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
63
3.4
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
DES
GENS
DER
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
VON
P.
REDIVIVUS
64
3.4.1
"SOUTHERN-BLOT"
MIT
GENOMISCHER
DNA
VON
P.
REDIVIVUS
64
3.4.2
ISOLIERUNG
EINES
VOLLSTAENDIGEN
KLONS
AUS
GENOMISCHEN
PHAGEN-BANKEN
66
3.4.3
PARTIELLE
RESTRIKTIONSANALYSE
DES
GENOMISCHEN
PHAGEN-KLONS
67
3.4.4
SEQUENZANALYSE
DER
GENOMISCHEN
REGION
DER
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
68
3.5
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
ORNITHIN
DECARBOXYLASE
VON
P.
REDIVIVUS
(PTRCHISB)
71
3.5.1
REINIGUNG
DER
RPODC
(PTRCHISB)
DURCH
NI
T
-CHELATCHROMATOGRAPHIE
73
3.5.2
CHARAKTERISIERUNG DER
RPODC
(PTRCHISB)
74
3.5.2.1
IDENTIFIZIERUNG
DES
REAKTIONSPRODUKTES
DER
VON
DER
RPODC
(PTRCHISB)
KATALYSIERTEN
ENZYMREAKTION
MITTELS
"REVERSED-PHASE"-HPLC
74
3.5.2.2
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTS
DER
RPODC
(PTRCHISB)
75
3.5.2.3
OPTIMALER
PH-WERT
DER
VON
DER
RPODC
(PTRCHISB)
KATALYSIERTEN
DECARBOXYLIERUNGS-REAKTION
76
3.5.2.4
ABHAENGIGKEIT
DER
RPODC
(PTRCHISB)
VON
PYRIDOXAL-PHOSPHAT
77
3.5.2.5
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
DER
RPODC
(PTRCHISB)
78
3.5.2.6
BESTIMMUNG
DES
KM-WERTES
DER
RPODC
(PTRCHISB)
FUER
L-ORNITHIN
78
3.5.2.7
HEMMUNG
DER
VON
DER
RPODC
(PTRCHISB)
KATALYSIERTEN
ENZYMREAKTION
79
3.6
EXPRESSION
DER
RPODC
(PJC20)
84
3.6.1
PARTIELLE
REINIGUNG
DER
RPODC
(PJC20)
84
3.6.2
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
DER
PARTIELL
GEREINIGTEN
RPODC
(PJC20)
87
3.6.3
BESTIMMUNG
DES
K
M
-WERTES
DER
PARTIELL
GEREINIGTEN
RPODC
(PJC20)
FUER
L-ORNITHIN
87
3.7
EXPRESSION
DER
RPODC
(PBSV8HIS)
88
3.7.1
REINIGUNG
DER
RPODC
(PBSV8HIS)
DURCH
NI
2+
-CHELATCHROMATOGRAPHIE
88
3.7.2
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
DER
RPODC
(PBSVSHIS)
90
3.7.3
BESTIMMUNG
DES
KM-WERTES
DER
RPODC
(PBSV8HIS)
FUER
L-ORNITHIN
90
3.8
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
AUFTRETEN
EINER
ORNITHIN
DECARBOXYLASE
BEI
PARASITISCHEN
NEMATODEN
91
3.8.1
NACHWEIS
DES
ORNITHIN-DECARBOXYLASE-PROTEINS
UEBER
ANTIKOERPER
91
3.8.2
PCR
MIT
GENOMISCHEN
DNAS
UNTERSCHIEDLICHER
ORGANISMEN
ZUR
ERZEUGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
DER
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
93
4
DISKUSSION
97
4.1
NACHWEIS
UND
ANALYSE
DES
TRANSKRIPTES
DER
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
VON
PANAGRELLUS
REDIVIVUS
97
4.2
NACHWEIS
UND
ANALYSE
DES
GENS
DER
ORNITHIN
DECARBOXYLASE
VON
P.
REDIVIVUS
104
4.3
ANALYSE
DES
REKOMBINANTEN
ORNITHIN-DECARBOXYLASE
PROTEINS
VON
P.
REDIVIVUS
110
4.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
AUFTRETEN
EINER
ORNITHIN
DECARBOXYLASE
BEI
PARASITISCHEN
NEMATODEN
116
5
ZUSAMMENFASSUNG
119
6
LITERATUR
123 |
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| spelling | Niemann, Gabriele Verfasser aut Molekulare Charakterisierung der Ornithin-Decarboxylase des Nematoden Panagrellus redivivus (Linné, 1767) vorgelegt von Gabriele Niemann 1996 [7], 143 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Hamburg, Univ., Diss., 1996 Panagrellus redivivus (DE-588)4434988-9 gnd rswk-swf Ornithindecarboxylase (DE-588)4313556-0 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Panagrellus redivivus (DE-588)4434988-9 s Ornithindecarboxylase (DE-588)4313556-0 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=007510576&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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