Untersuchungen zur Stabilität und GroEL-vermittelten Faltung von Ribonuklease T1:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG.
.
1
1.1.
STABILITAET
VON
PROTEINEN
.
1
1.1.1.
GRUNDLAGEN
DER
PROTEINSTABILITAET
.
2
1.1.2.
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
VON
UEBERGANGSKURVEN
.
4
1.1.3.
A-HELIZES
ALS
MODELLSYSTEM
.
5
1.2.
PROTEINFALTUNG
.
7
1.3.
MOLEKULARE
CHAPERONE
.
10
1.3.1.
KLASSIFIZIERUNG
DER
MOLEKULAREN
CHAPERONE
.
11
1.3.2.
GROEL
UND
GROES
.
12
1.4.
RIBONUKLEASE
TI
ALS
MODELLSYSTEM
.
16
1.5.
PROBLEMSTELLUNG
.
21
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
23
2.1.
MATERIALIEN
.
23
2.2.
ISOLIERUNG
VON
RNASE
TL-VARIANTEN
AUS
E.
COLI
DH5A
.
24
2.3.
ISOLIERUNG
VON
GROEL
AUS
E.COLI
BL21(DE3)
.
24
2.3.1.
TRANSFORMATION
VON
E
COAEBL21(DE3)MITDEMPLASMIDPT7GROE
.
25
2.3.2.
FERMENTATION
UND
ISOLIERUNG
DES
PROTEINROHEXTRAEKTS
.
25
2.3.3.
FRAKTIONIERTE
(NHUEJSC^-FAELLUNG
UND
GELFILTRATION
AN
SEPHACRYL
S-300
.
26
2.3.4.
ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE
AN
TMAE-FRACTOGEL
EMD-650
M
.
26
2.3.5.
HYDROPHOBE
CHROMATOGRAPHIE
AN
BUTYL-SEPHAROSE
4
FF
.
26
2.3.6.
AFISNITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
AFFIGEL
BLUE
.
27
2.3.7.
REINIGUNG
VON
GROES
.
27
2.4.
CHEMISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
S54G/P55N-RNASE
TI
.
27
2.4.1.
REDUKTION
UND
CARBAMIDIERUNG:
HERSTELLUNG
VON
RCAM-TL
.
27
2.4.2.
[
14
C]-MARKIERUNG
DURCH
REDUKTIVE
METHYLIERUNG
.
28
2.5.
PROTEINANALYTIK
.
28
2.5.1.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
28
2.5.2.
MASSENSPEKTROMETRIE
.
29
2.5.3.
NACHWEIS
EINER
BINDUNG
VON
RCAM-TL
AN
GROEL
.
29
2.6.
AUFNAHME
VON
PROTEINSPEKTREN
.
30
2.6.1.
ABSORPTIONSSPEKTREN,
SPEKTROMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
30
2.6.2.
ZIRKULARDICHROISMUS-SPEKTREN
.
30
2.6.3.
FLUORESZENZSPEKTREN
.
31
2.6.4.
LUMINESZENZTITRATION
VON
RNASE
TI
MIT
TBCL
3
.
32
2.7.
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
KONFORMATIONELLER
UEBERGAENGE
.
32
2.7.1.
THERMISCHE
UEBERGAENGE
VON
RNASE
TI
.
32
2.7.2.
AUSWERTUNG
DER
THERMISCHEN
UEBERGANGSKURVEN
.
33
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.3.
HAMSTOFF-INDUZIERTE
FALTUNGSUEBERGAENGE
VON
RNASE
TI
.
33
2.7.4.
NACL-INDUZIERTER
FALTUNGSUEBERGANG
VON
RCAM-TL
.
34
2.7.5.
AUSWERTUNG
DER
LOESUNGSMITTEL-INDUZIERTEN
UEBERGANGSKURVEN
.
34
2.8.
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
VON
FALTUNGSKINETIKEN
.
35
2.8.1.
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
HAMSTOFF-INDUZIERTEN
ENTFALTUNG
VON
RNASE
TI
.
35
2.8.2.
NACL-ABHAENGIGKEIT
DER
FALTUNGSKINETIK
VON
RCAM-TL
.
35
2.8.3.
GROEL-INDUZIERTE
ENTFALTUNG
VON
RCAM-TL
.
36
2.8.4.
KINETISCHE
ANALYSE
VON
REAKTIONEN
ERSTER
ORDNUNG
.
37
2.8.5.
BERECHNUNG
DER
MIKROSKOPISCHEN
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN
FUER
DIE
NACL-INDUZIERTE
FALTUNG
VON
RCAM-TL
.
38
2.8.6.
SIMULATION
DER
KINETIK
DER
GROEL-INDUZIERTEN
ENTFALTUNG
VON
RCAM-TL
.
39
2.9.
AKTIVITAETSTESTS
.
40
2.9.1.
RNASE
TI
.
40
2.9.2.
A-GLUKOSIDASE
.
41
2.9.3.
GROEL/GROES
.
41
3.1.
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
HELIXVARIANTEN
.
42
3.1.1.
REINIGUNG
VON
RIBONUKLEASE
TI
AUSE.
CO/ZDH5A
PA2TL
.
42
3.1.2.
MASSENSPEKTREN
UND
GELEKTROPHORESE
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
43
3.1.3.
ZIRKULARDICHROISMUS-SPEKTREN
.
45
3.1.4.
ENZYMATISCHE
AKTIVITAET
.
49
3.2.
THERMODYNAMISCHE
STABILITAET
DER
HELIXVARIANTEN
.
50
3.2.1.
THERMODYNAMISCHE
KOPPLUNG
ZWISCHEN
DEPROTONIERUNG
UND
ENTFALTUNG
.
51
3.2.2.
DIE
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
THERMISCHEN
STABILITAET
VON
RNASE
TI
.
53
3.2.3.
DER
EINFLUSS
VON
GLU-28
AUF
DIE
THERMISCHE
STABILITAET
.
54
3.2.4.
DER
EINFLUSS
VON
ASP-29
AUF
DIE
THERMISCHE
STABILITAET
.
55
3.2.5.
DIE
PH-ABHAENGIGE
STABILITAET
DER
DOPPELMUTANTEN
E28Q/D29N
UND
E28Q/D29H-RNASE
TI
.
57
3.2.6.
HAMSTOFF-INDUZIERTE
ENTFALTUNG
BEI
PH
7
.
60
3.2.7.
DIE
SALZABHAENGIGKEIT
DER
KONFORMATIONELLEN
STABILITAET
.
62
3.2.8.
NACHWEIS
EINER
KATIONENBINDUNGSSTELLE
DURCH
LUMINESZENZTITRATION
MIT
TBCL
3
.
66
3.3.
EINFLUSS
DER
DEPROTONIERUNG
VON
GLU-28
UND
ASP-29
AUF
DIE
ENTFALTUNGS
GESCHWINDIGKEIT
.
69
3.3.1.
PH-PROFIL
DER
ENTFALTUNGSGESCHWINDIGKEIT
VON
E28Q-RNASE
TI
.
69
3.3.2.
PH-PROFIL
DER
ENTFALTUNGSGESCHWINDIGKEIT
VON
D29N-RNASE
TI
.
72
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.3.3.
VERGLEICH
DER
ENTFALTUNGSGESCHWINDIGKEITEN
VON
EINZEL
UND
DOPPEL
MUTANTE
.
73
3.4.
ISOLIERUNG
VON
GROEL
AUS
E.
COLI
BL21(DE3)
PT7GROE
UND
ERSTE
CHARAKTERISIERUNG
.
75
3.4.1.
REINIGUNG
VON
GROEL
.
75
3.4.2.
SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.
76
3.4.3.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG:
GLUKOSIDASE-AKTIVITAETSTEST
.
81
3.5.
RCAM-TL
ALS
SUBSTRAT
FUER
DIE
UNTERSUCHUNG
DER
GROEL-INDUZIERTEN
ENTFALTUNG
VON
PROTEINEN
.
83
3.5.1.
RCAM-TL
BILDET
BEI
HOHEN
NACL-KONZENTRATIONEN
EINE
NATIV-AEHNLICHE
STRUKTUR
AUS
.
85
3.5.2.
DIE
FALTUNGSKINETIK
VON
RCAM-TL
WIRD
DURCH
EIN
DREI-SPEZIES-MODELL
BESCHRIEBEN
.
89
3.5.3.
DIE
BINDUNG
VON
RCAM-TL
AN
GROEL
IST
ABHAENGIG
VON
DER
LONENSTAERKE
.
92
3.6.
DER
MECHANISMUS
DER
GROEL-INDUZIERTEN
ENTFALTUNG
VON
RCAM-TL
.
95
3.6.1.
RCAM-TL
WIRD
DURCH
GROEL
ENTFALTET
.
95
3.6.2.
EINFLUSS
VON
ATP
UND
ADP
AUF
DIE
ENTFALTUNGSAKTIVITAET
VON
GROEL
.
98
3.6.3.
DAS
MODELL
DER
THERMODYNAMISCHEN
KOPPLUNG
FUER
DIE
GROEL-INDUZIERTE
ENTFALTUNG
VON
RCAM-TL
.
100
4.
DISKUSSION
.
104
4.1.
EINFLUSS
VON
GLU-28
UND
ASP-29
AUF
DIE
STABILITAET
VON
RIBONUKLEASE
TI
.
104
4.2.
GROEL-INDUZIERTE
ENTFALTUNG
VON
RCAM-TL
.
109
4.3.
SCHLUSSBEMERKUNG
.
116
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
117
6.
SUMMARY
.
120
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
123
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
125 |
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