Ein neuer Wirkungsbereich von Activin: die Wundheilung der Haut
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| adam_text | 3 DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER CHEMIE
UND PHARMAZIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN EIN NEUER
WIRKUNGSBEREICH VON ACTIVIN: DIE WUNDHEILUNG DER HAUT VON GRISELDIS
HUEBNER AUS BONN-DUISDORF 1996 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 1.1 DIE
TRANSFORMING GROWTH FACTOR SS SUPERFAMILIE 1 1.1.1 DIE FAMILIE DER
ACTIVINE UND INHIBINE 1 1.1.2 DIE ACTIVINREZEPTOREN UND ANDERE
BINDUNGSPROTEINE 2 1.1.3 DIE EXPRESSION UND ROLLE VON ACTIVIN WAEHREND
DER EMBRYONALENTWICKLUNG 5 1.2 DIE HAUT 7 1.2.1 AUFBAU DER HAUT 7 1.2.2
DIE WUNDHEILUNG DER HAUT 8 1.2.3 DIE ROLLE DER TGFSS-SUPERFAMILIE IN DER
HAUT UND WAEHREND DER WUNDHEILUNG 11 1.3 ZIEL DER ARBEIT 12 2 MATERIAL
UND METHODEN . 14 2.1 CHEMIKALIEN 14 2.2 ANTIBIOTIKA 14 2.3 ANTIKOERPER
15 2.4 BIOLOGISCHES MATERIAL 15 2.4.1 BAKTERIENSTAEMME 15 2.4.2
EUKARYONTISCHE ZELLEN 15 2.4.3 GEWEBE 15 2.4.3.1 MENSCHLICHES GEWEBE 15
2.4.3.2 GEWEBE VON MAEUSEN 16 2.5 ENZYME 16 2.6 MEDIEN UND
PLASTIKMATERIAL FUER DIE ZELLKULTUR 16 2.7 NUKLEINSAEUREN 16 2.
7.10LIGODESOXYNUKLEOTIDE * 16 2.7.2 PLASMIDE 17 2.7.3 SEQUENZEN DER
HYBRIDISIERUNGSPROBEN FUER RNASE PROTECTION ASSAY 18 2.8
WACHSTUMSFAKTOREN UND ZYTOKINE 19 2.9 GERAETE 19 2.10 HAEUFIG VERWENDETE
LOESUNGEN 19 2.11 MATERIAL FUER DIE IN SITU HYBRIDISIERUNG 20 2.12
MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 20 2.12.1 ANZUCHT VON ESCHERICHIA COLI 20
2.12.1.1 FLUESSIGKULTUREN 21 2.12.1.2 KULTUREN AUF AGARPLATTEN 21
2.12.1.3 GLYCERINKULTUREN 21 2.12.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI
BAKTERIEN 21 2.12.3 TRANSFORMATION VON E. COLI UND BLAUAVEISS-SELEKTION
21 2.12.3.1 TRANSFORMATION 21 2.12.3.2 BLAU/WEISS-SELEKTION 21 2.13
DNA-METHODEN 22 2.13.1 HERSTELLUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 22 2.13.2
PLASMIDISOLIERUNG IM KLEINEN MASSSTAB AUS E. COLI 22 2. F 3.3
PLASMIDISOLIERUNG IM GROSSEN MASSSTAB AUS E. COLI 22 2.13.4 AUFTRENNUNG
VON DNA DURCH GELELEKTROPHORESE 23 2.13.5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
DNA 23 2.13.6 EXTRAKTION VON DNA MIT PHENOL UND CHLOROFORM 23 2.13.7
FAELLUNG VON DNA AUS WAESSRIGER LOESUNG MIT ETHANOL UND SALZ 23 2. 13.8
ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA 23 2.13.8.1 SCHNEIDEN VON DNA MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN 23 2.13.8.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 24
2.13.8.3 VERKNUEPFUNG VON DNA MIT T4-DNA LIGASE 24 2.13.9 ELUTION VON
DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 24 2.13.10 SEQUENZIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER DNA 24 2.13.11 HERSTELLUNG VON CDNA 25 2.13.12
AMPLIFIKATION UND KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS PCR 25 2.13.12.1
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 25 2.13.12.2 AUFFUELLEN UEBERHAENGENDER
3 -ENDEN MIT KLENOW DNA-POLYMERASE 26 2.13.12.3 AUFTRENNUNG VON
PCR-FRAGMENTEN UND LIGATION 26 2.14 RNA-METHODEN 26 2.14.1 HERSTELLUNG
VON RNASE-FREIEN LOESUNGEN UND GEFAESSEN 26 2.14.2 ISOLIERUNG VON
GESAMTZELLULAERER RNA 26 2.14.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA 27 2.
14.4 VORBEREITUNG EINES PLASMIDES FUER DIE IN VITRO TRANSKRIPTION 27
2.14.5 RNASE PROTECTION ASSAY 28 2.14.6 RNA-RNA IN SITU HYBRIDISIERUNG
VON GEWEBESCHNITTEN 30 2.14.6.1 IN SITU HYBRIDISIERUNG VON
PARAFFINSCHNITTEN 31 2.14.6.2 IN SITU HYBRIDISIERUNG VON
GEFRIERSCHNITTEN 33 2.15 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 34 2. 15.1
HERSTELLUNG VON ZELLYSATEN AUS KULTIVIERTEN ZELLEN 34 2.15.2 FAELLUNG VON
PROTEINEN MIT TRICHLORESSIGSAEURE 35 2.15.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
PROTEINEN 35 2.15.4 DISKONTINUIERIICHE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 35 2.15.5 FAERBUNG VON PROTEINGELEN
MIT COOMASSIE BRILLIANTBLAU 36 2.15.6 FAERBUNG VON PROTEINGELEN MIT
SILBER 36 2.15.7 EXPRESSION UND REINIGUNG VON REKOMBINANTEN PROTEINEN
AUS E. COLI 36 2.16 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 37 2.16.1 ERZEUGUNG EINES
POLYKLONALEN ACTIVIN-SPEZIFISCHEN ANTISERUMS 37 2.16.2 IMMUNHISTOCHEMIE
37 2.16.3 IMMUNZYTOCHEMIE 38 2.16.4 IMMUNPRAEZIPITATION 39 2.16.5
WESTERNBLOT 39 2.17 HISTOLOGISCHE METHODEN 40 2.17.1 EINBETTEN VON
GEWEBE 40 2.17.1.1 EINBETTEN VON GEWEBE FUER PARAFFRNSCHNITTE 40 2.17.1.2
EINBETTEN VON GEWEBE FUER GEFRIERSCHNITTE 41 2.17.2 SILANISIEREN VON
OBJEKTTRAEGEM 41 2.17.3 ANFERTIGEN VON GEFRIER- UND PARAFFINSCHNITTEN 41
2.17.4 HAEMATOXYLIN/EOSIN-FAERBUNG 41 2.18 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 42
2.18.1 KULTUR EUKARYONTISCHER ZELLEN 42 2.18.2 BEHANDLUNG VON
QUIESZENTEN ZELLEN MIT SERUM ODER WACHSTUMSFAKTOREN 43 2.18.3 TRANSIENTE
TRANSFEKTION VON COS-ZELLEN 43 2.18.4 STABILE TRANSFEKTION VON
HACAT-KERATINOZYTEN 44 2.18.5 NACHWEIS VON APOPTOTISCHEN ZELLEN 44
2.18.6 NACHWEIS VON PROLIFERIERENDEN ZELLEN DURCH BROMDESOXYURIDIN 44
2.19 SONSTIGE METHODEN 45 2. 19.1 GEWINNUNG VON WUNDGEWEBE AUS MAEUSEN 45
2.19.2 TRENNUNG VON DERMIS UND EPIDERMIS 45 2.19.3 GEWINNUNG VON
BIUTPLAETTCHEN-FREIEM UND NORMALEM HUMANSERUM 46 3 ERGEBNISSE 47 3.1
EXPRESSION VON ACTIVIN, INHIBIN, ACTIVINREZEPTOREN UND FOLLISTATIN IN
DER HAUT 47 UND WAEHREND DER WUNDHEILUNG 3.1.1 NACHWEIS VON ACTIVIN,
INHIBIN, ACTIVINREZEPTOR UND FOLLISTATIN MRNA IN DENNIS 47 UND EPIDERMIS
DER SCHWANZHAUT DER MAUS 3. 1.2 EXPRESSION VON ACTIVIN UND INHIBIN MRNA
WAEHREND DER WUNDHEILUNG 48 3.1.3 EXPRESSION VON ACTIVINREZEPTOR UND
FOLLISTATIN MRNA WAEHREND DER WUNDHEILUNG 50 3.1.4 LOKALISIERUNG DER
ACTIVIN SS A UND SS B MRNA IN DER WUNDE 51 3.1.5 LOKALISIERUNG VON ACTIVIN
PROTEIN IN DER WUNDE 54 3.1.5.1 ERZEUGUNG UND CHARAKTERISIERUNGEINES
POLYKLONALEN ACTIVIN-SPEZIFISCHEN ANTISERUMS 54 3.1.5.2 LOKALISIERUNG
VON ACTIVIN IN DER NORMALEN HAUT UND IN VERWUNDETEM GEWEBE 55 3. 1.6
ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG 1 60 3.2 REGULATION DER EXPRESSION VON ACTIVIN
DURCH WACHSTUMSFAKTOREN UND 60 ZYTOKINE IN VITRO 3.2.1 REGULATION DER
EXPRESSION VON ACTIVIN IN FIBROBLASTEN 61 3.2.1.1 INDUKTION DER ACTIVIN
MRNA EXPRESSION DURCH SERUM 61 3.2.1.2 EXPRESSION VON ACTIVINREZEPTOREN
UND FOLLISTATIN NACH STIMULATION 62 DER ZELLEN MIT SERUM 3.2.1.3
INDUKTION DER ACTIVIN A EXPRESSION DURCH GEREINIGTE WACHSTUMSFAKTOREN 63
AUS DEM SERUM 3.2.1.4 PROINFLAMMATORISCHE ZYTOKINE STIMULIEREN DIE
EXPRESSION VON ACTIVIN A 65 3.2. 2 REGULATION DER EXPRESSION VON ACTIVIN
IN KERATINOZYTEN 65 3.2.3 DIE INDUKTION DER ACTIVIN SS& MRNA SYNTHESE IN
VITRO KORRELIERT MIT DER SEKRETION 67 DES PROTEINS IN DAS KULTURMEDIUM
3.2.4 ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG 2 68 3.3 EXPRESSION UND LOKALISIERUNG VON
PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN WAEHREND 69 DER WUNDHEILUNG 3.3.1
EXPRESSION VON PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN NACH VERWUNDUNG 69 3.3.2
LOKALISIERUNG DER ZYTOKINE IM WUNDGEWEBE 72 3.3.3
ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG 3 73 3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON ACTIVIN
IN DER HAUT UND WAEHREND 73 DER WUNDHEILUNG 3. 4.1 HERSTELLUNG UND
CHARAKTERISIERUNG STABILER KERATINOZYTEN-LINIEN, DIE ACTIVIN A 74
KONSTITUTIV SEZERNIEREN 3.4.1.1 UNTERSUCHUNG DER ACTIVIN-LINIEN AUF
VERAENDERTE PROLIFERATIONSRATE 75 3.4.1.2 UNTERSUCHUNG ZUR
DIFFERENZIERUNG DER ACTIVIN-LINIEN 76 3.4.1.3 UNTERSUCHUNG DER
ACTIVIN-LINIEN AUF VERAENDERTE APOPTOSERATE 77 3.4.1.4 EXPRESSION VON
ACTIVIN SS^ TGFSSL,2 UND 3 IN DEN ACTIVIN-LINIEN 77 3.4.1.5 EXPRESSION VON
CTGF IN HACAT-KERATINOZYTEN UND IN DEN ACTIVIN-LINIEN 78 3.4.1.6
EXPRESSION WEITERER FAKTOREN IN DEN ACTIVIN-LINIEN 78 3.4.2 ACTIVIN
STIMULIERT DIE MRNA EXPRESSION VON FIBRONECTIN IN FIBROBLASTEN 79 3.4.3
EXPRESSION VON ACTIVIN IN NORMALER HAUT UND BEI HYPERPROLIFERATIVEN 80
HAUTKRANKHEITEN DES MENSCHEN 3.4.4 ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG 4 81 3.5 DIE
EXPRESSION VON ACTIVIN IN EINEM ANDEREN GEWEBE MIT 82
MESENCHYMAL/EPIDERMALEM AUFBAU 3.5. 1 EXPRESSION VON ACTIVIN IM
VERDAUUNGSTRAKT 83 3. 5.2 EXPRESSION VON ACTIVIN BEI ENTZUENDLICHEN
DARMERKRANKUNGEN 83 3.5.3 LOKALISIERUNG VON ACTIVIN SS A MRNA IM DANN VON
PATIENTEN MIT 85 ENTZUENDLICHEN DANVERI 3.5.4 ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG 5
86 4 DISKUSSION 88 4.1 DIE EXPRESSION UND LOKALISATION VON ACTIVIN UND
SEINER BINDUNGSPROTEINE IN 88 DER HAUT UND WAEHREND DER WUNDHEILUNG 4.2
DIE REGULATION DER EXPRESSION VON ACTIVIN SS A DURCH WACHSTUMSFAKTOREN 90
UND ZYTOKINE IN VITRO 4.3 DIE EXPRESSION VON PROINFLAMMATORISCHEN
ZYTOKINEN IN VIVO 92 4.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON ACTIVIN IN DER
UNVERLETZTEN HAUT UND 94 WAEHREND DER WUNDHEILUNG 4.5 ACTIVIN IN DER
WUNDHEILUNG: EIN MODELL - 98 4.6 IST DIE EXPRESSION VON ACTIVIN
ALLGEMEIN MIT ENTZUENDUNGSVORGAENGEN 100 GEKOPPELT? 4.7 AUSBLICK 101 5
ZUSAMMENFASSUNG 102 6 REFERENZEN 104 7 LEBENSLAUF 120
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