Untersuchungen zu den Zebrafischgenen ZfE12 und Zfgroucho während der Embryogenese:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
|
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
I
1
1
ENTSTEHUNG
VON
ZELLDIVERSITAET:
FIXIERUNG
VERSCHIEDENER
ZELLSCHICKSALE
.
1
1
2
NEUROGENESE
IN
VERTEBRATEN
.
2
1
3
LATERALE
INHIBITION:
DROSOPHR/A-NEUROGENESE
ALS
MODELLSYSTEM
.
5
1
4
DAUGHTERLESS/E12-BASISCHE-HELIX-LOOP-HELIX-PROTEINE
MIT
PRONEURALER
FUNKTION.
7
1
5
DROSOPHILA
GROUCHO:
EIN
NEUROGENES
GEN
MIT
MULTIPLEN
FUNKTIONEN
.
7
1
6
ZEBRAFISCH
ALS
MODELL
FUER
VERTEBRATENNEUROGENESE
.
9
17
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
IO
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
N
2
1
CHEMIKALIEN
.
11
2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITEN
.
12
2.2.1
BAKTERIEN-UND
HEFESTAEMME
.
12
2.2.2
VERSCHIEDENE
VEKTOREN
ZUR
KLONIERUNG,
ZUR
BAKTERIELLEN
UND
ZUR
HEFEEXPRESSION
.
12
2.2.3
GENBANKEN
.
13
2
2.4
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
13
2.2.5
PCR
.
14
2
2
5.1
PCR-DELETIONSMUTAGENESE
ZUR
HERSTELLUNG
VON
ZFGROUCHO
UND
HER4-HEFE
KONSTUKTEN
.
15
2.2.5.2
AUFREINIGUNG
UND
ENZYMATISCHE
MODIFIKATIONEN
DER
PCR-FRAGMENTE
.
15
2
2
6
NUKLEINAEUREPRAEPARATIONEN
.
16
2.2
6
1
STET-PRAEPARATIONEN
VON DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
.
16
2.2.6.2
PLASMID-GROSSPRAEPARATIONEN
.
16
2.2.6
3
ISOLATION
VON
GENOMISCHER
ZEBRAFISCH-DNA
.
16
2
2.6.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
17
2
2.7
GROESSENSEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
17
2.2.8
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
17
2.2.9
SUBKLONIERUNG
.
17
2
2.9.1
LIGATION
.
17
2
2.9.2
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
.
18
2.2.9.3
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
19
2
2
10
DNA-SEQUENZIERUNG
.
19
2.2
10.1
VORBEREITUNG
DER
PLASMID-DNA
.
19
2.2.10.2
DENATURIERUNG
.
19
2.2.10.3
ANLAGERUNG
DES
PRIMER
.
19
2.2.10.4
SEQUENZREAKTION
.
20
2.2.10.5
AUFTRENNUNG
DURCH
ELEKTROLYT-GRADIENTEN-PAGE,
FIXIERUNG
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
20
2.2.10
6
SEQUENZANALYSE
.
20
2.2.10.7
DELETIONSKLONE
.
20
2
2
11
FILTER-TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
.
20
2
2
111
TRANSFER
VON
DNA
.
20
2.2.12
SICHTEN
EINER
CDNA-BANK
.
21
2
2
12.1
HERSTELLUNG
VON
PLATTENLYSATEN
.
21
2.2.12.2
IN
VFVO-EXZISION
.
21
2.2.13
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
.
22
2.2
14
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
AN
FILTERGEBUNDENE
NUKLEINSAEUREN
.
22
2.2
14.1
MODERAT
STRINGENTE
HYBRIDISIERUNG
VON
PLAQUE-LIFTINGS
DES
ZFTYO-SCREENS
.
22
2.2.14.2
HOCH
STRINGENTE
HYBNDISIERUNG
AN
GENOMISCHER
ZEBRAFISCH-DNA
.
23
2.2.14.3
HYBRIDISIERUNG
AN
PLASMID-BLOTS
.
23
2.2.14
4
HOCH
STRINGENTE
HYBRIDISIERUNG
AN
RNA
.
23
2.3
HISTOLOGISCHE
TECHNIKEN
.
23
2
3.1
VERWENDETE
ANTIKOERPER
.
23
2.3.2
ANTIKOERPERFAERBUNGEN
AN
FLIEGENEMBRYONEN
.
24
2.3.3
ANTIKOERPERFAERBUNGEN
AN
FISCHEMBRYONEN
.
24
2.3.4
RNA
IN
SITU-HYBRIDISIERUNGEN
AN
FISCHEMBRYONEN
.
25
2
3.4
1
PROBENHERSTELLUNG
.
25
2.3.4
2
RNA-IN
SITU-HYBRIDISIERUNGEN
AN
ZEBRAFISCHEMBRYONEN
MIT
DIGOXIGENIN-MARIUERTEN
SONDEN
.
25
2
3
4.3
DEHYDRIERUNG
UND
EINBETTUNG
IN
ARALDIT
.
26
2
3.5
DOPPELFARBUNGEN
AN
ZEBRAFISCHEMBRYONEN
.
26
2
3.5.1
RNA-IN
SITU-HYBRIDISIERUNGEN
UND
ANTIKOERPERFAERBUNGEN
AN
ZEBRAFISCHEMBRYONEN.
.
26
2
3.5
2
DOPPEL
RNA-RH
SITU-HYBRIDISIERUNGEN
.
27
2.3.5.3
EINBETTUNG
IN
GLYCERIN
.
27
2.4
PROTEINCHEMISCHE
ARBEITEN
.
27
2.4
1
KONSTRUKTION
DER
ZFE12-FUSIONSKONSTRUKTE
.
27
2.4
2
PROTEINEXPRESSION
IN
BAKTERIEN
.
28
2.4.2.1
INDUKTION
VON
PATH-FUSIONSPROTEINEN
.
28
2
4
2.2.
INDUKTION
VON
PGEX-FUSIONSPROTEINEN
.
28
2
4.2.3
ANALYTISCHE
PROTEINGELE
.
28
2
4.3
AGGREGATREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
28
2.4.4
IMMUNISIERUNG
.
29
2.4.5
WESTERN-BLOT
.
29
2.4
5
1
METHODE
.
29
2.4.5.2
ZEBRAFISCHWESTEM
BLOT
.
30
2.5
HEFEARBEITEN
.
30
2
5.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
HEFEZELLEN
UND
TRANSFORMATION
.
30
2.5.1.1
KOMPETENTE
HEFEZELLEN
.
30
2
5.1.2
TRANSFORMATION
.
30
2.5.2
HERSTELLUNG
DER
ZFGRO-UND
HER4-HEFEFUSIONSKONSTRUKTE
.
31
2.5.2.1
HERSTELLUNG
DES
Z^RO-MINIGENS
.
31
2.5.2
2
VORBEREITUNG
DES
VEKTORS
.
31
2.5.3
INTERAKTIONSTEST
.
31
2.6
GENETISCHE
ARBEITEN
.
32
2.6.1
FLIEGENSTAEMME,
CHROMOSOMEN
UND
ALLELE
.
32
2.6.2
FLIEGENZUCHT
UND
KREUZUNGEN
.
33
2.6.3
EIABLAGEN
.
33
2.6.4
BESTIMMUNG
DER
LETALITAET
.
33
2
6.4.1
BESTIMMUNG
DER
EMBRYONALEN
LETALITAET
.
33
2.6.4.2
BESTIMMUNG
DER
LARVALEN
UND
PUPALEN
LETALITAET
DER
TRANSGENEN
KREUZUNGS
EXPERIMENTE
.
33
3.
ERGEBNISSE
VON
TEIL
1
.
34
3.1
ZFE12
IST
EIN
MITGLIED
DER
E2A-PROTEINFAMILIE
.
34
3.2
ZEITLICHE
UND
RAEUMLICHE
VERTEILUNG
DER
ZFE1
2-1
RANSKRIPTE
.
36
3.2.1
DAS
ENTWICKLUNGSPROFIL
DER
ZTE12-TRANSKRIPTE
.
36
3.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
RAEUMLICHEN
VERTEILUNG
VON
ZIE12-TRANSKRIPTEN
WAEHREND
DER
EMBRYOGENESE
.
38
3.3
ZFE12-PROTEINVERTEILUNG
WAEHREND
DER
EMBRYOGENESE
.
42
3.3.1
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
DAS
ZFE12-PROTEIN
.
42
3.3.1.1
KLONIERUNG
VON
ZFE12-FUSIONSPROTEINEN
.
43
3.3.1.2
BAKTERIELLE
PROTEININDUKTION
UND
ANREICHERUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
.
44
3.3.1.3
IMMUNISIERUNG
VON
BALB/C
MAEUSEN
MIT
DEN
FUSIONSPROTEINEN
.
48
3.3.1.4
KREUZREAKTION
DER
ANTISEREN
MIT
DEN
FUSIONSPROTEINEN
.
48
3
3.2
NACHWEIS
EINER
REAKTION
DES
ANTISERUMS
A-GEX
B-R1
AUF
ZEBRAFISCHEMBRYONEN
.
49
3.3.2.1
KREUZREAKTION
MIT
ZEBRAFISCHEMBRYONENEXTRAKTEN
.
SO
3.3.2.2
ANTIKOERPERFAERBUNG
VON
'
WHOLE
MOUNT
'
-ZEBRAFISCHEMBRYONEN
.
52
3.4
FUNKTIONELLER
TEST
DER
BIOLOGISCHEN
AKTIVITAET
DER
BHLH-DOMAENE
VON
ZFE12
IN
DROSOPHILA
.
55
3.4
1
ANALYSE
DER
REKONSTITUTION
DER
NERVENSYSTEMDEFEKTE
DURCH
DIE
VERSCHIEDENEN
CHIMAEREN
DA/ZFE12-FUSIONPROTEINE
.
57
3
4
2
BESTIMMUNG
DER
EMBRYONALEN
UND
LARVALEN
LETALITAET
DER
TRANSGENEN
HOMOZYGOTEN
DAUGHTERLESS-TIERE
.
61
3
4
3
TRANSHETEROZYGOTE
FUER
ZWEI
DAUGHFERTESS-EMBRYONAL
LETALE
MUTATIONEN
KOENNEN
BIS
ZUR
IMAGO
GERETTET
WERDEN
.
63
4.
DISKUSSION
VON
TEIL
1
.
66
4.1
Z/E12-GENEXPRESSION
IST
AUF
TRANSKRIPTIONELLER
UND
POSTTRANSKRIPTIONELLER
EBENE
REGULIERT
.
66
411
ZEITLICHE
REGULATION
DER
TRANSKNPTE
.
66
4.1
2
EINE
REGULATION
DER
ZFE12-FUNKTION
FINDET
AUF
POSTTRANSLATIONALER
EBENE
STATT
.
67
4
2
ZFE12
-
MULTIPLE
FUNKTIONEN
WAEHREND
DER
EMBRYOGENESE?
.
68
4.2
1
ZFE12-EXPRESSION
UND
ZELLDIFFERENZIERUNG
.
68
4.2.2
INTERAKTIONSPARTNER
FUER
ZFE1
2
.
69
4.2
2
1
DIE
BHLH-DOMAENE
VON
ZFE1
2
BESITZT
IN
V/VO-DIMERISIERUNGSFUNKTION
.
69
4
2.2
2
INTERAKTIONEN
WAEHREND
DER
MYOGENESE
UND
DER
NEUROGENESE
.
70
5.
ERGEBNISSE
VON
TEIL
2
.
74
5
1
ISOLIERUNG
UND
STRUKTURELLE
CHARAKTENSIERUNG
VON
ZFGRO
.
H
5.11
ISOLIERUNG
VON
ZFGRO-CDNA-KLONEN
.
74
512
SEQUENZANALYSE
DER
ZFGRO-CDNAS
.
76
5.2
ANALYSE
DER
PROTEINSTRUKTUR
VON
ZFGROUCHO
UND
ANDEREN
GROUCHO-HOMOLOGEN
PROTEINEN
.
79
52
1
DOMAENENSTRUKTUR
DER
GROUCHO-HOMOLOGEN
PROTEINE
.
79
5
2
2
DIE
ZFGROUCHO-PROTEINE
SIND
GROUCHO-HOMOLOGE
.
84
5
3
UNTERSUCHUNG
ZUR
VERTEILUNG
DER
ZFGRO-TRANSKRIPTE
.
85
5.31
STADIENSPEZIFISCHE
TRANSKRIPTVERTEILUNG
.
85
5.3
2
RAEUMLICHE
VERTEILUNG
DER
ZFGRO-TRANSKNPTE
.
87
5.3.2.1
DAS
EXPRESSIONSMUSTER
VON
ZFGROL
.
88
5.3.2
2
DAS
EXPRESSIONSMUSTER
VON
ZFGRO2
.
97
5
3.3
VERGLEICH
MIT
DEN
EXPRESSIONSDOMAENEN
DER
GENE
NOTCH
UND
HER6
IM
FISCH
.
101
5
4
EXPERIMENTE
ZUR
DIREKTEN
PROTEININTERAKTION
VON
ZEBRAFISCH
GROUCHO
MIT
DEN
HER
PROTEINEN
.
107
5
4
1
DAS
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
DER
HEFE
ALS
TEST
FUER
PROTEIN-PROTEININTERAKTIONEN
.
107
5.4.2
KONSTRUKTION
DER
CHIMAEREN
HEFEKONSTUKTE
VON ZFGROUCHO2
UND
HER-4
.
108
5.4
2
1
HERSTELLUNG
VERSCHIEDENER
DELETIONEN
VON
ZFGRO
UND
HER-4
MITTELS
PCR-MUTAGENESE
108
5.4.2
2
KLONIERUNG
DER
CHIMAEREN
HEFEKONSTRUKTE
GAL4
DB-HER-4
UND
GAL4
TA-AGROUCHO
109
5.4
3
IN
VAERO-INTERAKTIONSSTUDIEN
ZWISCHEN
HER-4
UND
ZFGROUCHO
IN
DER
HEFE
.
113
6.
DISKUSSION
VON
TEIL
2
.
119
6
1
ZFGROUCHO
-
EIN
STRUKTURHOMOLOG
DES
TLE3-PROTEINS
DER
GROUCHO-FAMILIE.
.
119
6
1
1
STUKTURELLE
DOMAENEN
VON
ZFGROUCHO
UND
DEREN
MUTMASSLICHE
FUNKTION
.
119
6.1
2
ZFGROUCHO
1
UND
2
-
EINE
GENDUPLIKATION?
.
120
6.2
DIFFERENTIELLE
REGULATION
DER
EXPRESSION
DER
ZFGRO-GENE
.
121
6.2.1
EXPRESSION
VON
ZFGROL
UND
2
IST
ZEITLICH
REGULIERT
EXPRIMIERT
.
121
6
3
ZFGRO-GENE
-
AUFRECHTERHALTUNG
EINES
UNDIFFERENZIERTEN
ZUSTANDES
VON
VORLAEUFERZELLEN?
122
6
3
1
Z/GRO-EXPRESSION
IN
DEN
SOMITEN
.
122
6.3
2
ZFGRO-GENE
UND
DIE
DIFFERENZIERUNG
PNMAERER
NEURONE
.
123
6.4
ZFGROL
UND
-2
-
EINE
BETEILIGUNG
BEI
DER
FESTLEGUNG
VON
POSTENOREN
KOMPARTIMENTS
GRENZEN?
.
125
6.4.1
SEGMENTIERUNG
WAEHREND
DER
NEUROGENESE
.
125
64
2
FESTLEGUNG
DER
POSTERIOREN
SOMITENGRENZEN?
.
128
6.5
KONSERVIERUNG
DES
LATERAL
INHIBIERENDEN
MECHANISMUS
IM
ZEBRAFISCH?
.
125
6
5.1
KOEXPRESSION
DER
NEUROGENEN
GENE
.
129
6.5
2
FUNKTIONALITAET
DER
GROUCHO/HER-INTERAKTION
.
131
6.5.3
ABSCHLIESSENDE
BEMERKUNG
.
132
7.
ZUSAMMENFASSUNGEN
.
134
TEIL
1
.
134
TEIL
2
.
136
8.
BIBLIOGRAPHIE
.
137
9.
ANHANG
.
145
9
1
CDNA-SEQUENZEN
.
145 |
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