NGF-induzierte Regulation von Ras-abhängigen Promotorelementen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
|
| Schlagworte: | |
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| Beschreibung: | Bochum, Univ., Diss., 1996 |
| Beschreibung: | III, 140 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
I-III
L
EINLEITUNG
.
1
H.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
12
N.L
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
MATERIALIEN
.
12
N.2
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
13
II.2.
1
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
.
14
II.2.2
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
14
H.3
ARBEITSMETHODEN
.
15
II.3.1
ZELLKULTUR
.
15
N.3.1.1
SEKUNDAERE
ZELLINIEN
.
15
II.3.
1.1.1
KULTIVIERUNG
VON
PHEOCHROMOCYTOMA
(PC12)
ZELLEN
.
15
II.3.
1.1.2
KULTIVIERUNG
DER
PC12
ZELLINIE
GSRASDNL
.
15
II.3.1.1.3
INKUBATION
DER
PC12
ZELLEN
MIT
NEUROTROPHEN
UND
WACHSTUMSFAKTOREN
.
16
II.3.
1.1.4
INKUBATION
MIT
IL-1,
GLUTAMAT
UND
CARBACHOL
.
16
II.3
.1.1.5
SCHAEDIGUNG
DER
PC
12
ZELLEN
MIT
H2O2.
16
II.3.
1.1.6
KULTIVIERUNG
VON
NIH
3T3
ZELLEN
.
17
II.3.
1.1.7
INKUBATION
DER
NIH
3T3
ZELLEN
MIT
IL-1,
XANTHIN
UND
XANTHINOXIDASE
.
17
II.3.1.2
PRIMAERKULTUR
.
17
II.3
.1.2.1
PRAEPARATION
DER
ISCHIASNERVEN
NEONATALER
RATTEN
UND
KULTIVIERUNG
PRIMAERER
FIBROBLASTEN
.
17
II.3.
1.2.2
SUBKULTIVIERUNG
PRIMAERER
RATTENFIBROBLASTEN
.
18
II.3.2
TRANSFEKTIONSMETHODEN
.
18
II.3
.2.1
TRANSFEKTION
VON
FIBROBLASTEN
NACH
DER
CALCIUMPHOSHATPRAEZIPITATIONSME
THODE
.
18
II.3.2.2
TRANSFEKTION
VON
PC12
ZELLEN
.
19
II.3.2.3
STABILE
TRANSFEKTIONEN
.
20
11,3.3
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZEN
.
20
N.3.3.1
SS-GALACTOSIDASENACHWEIS
.
20
N.3.3.2
NACHWEIS
DES
GREENFLUORESCENTPROTEIN
(GFP)
.
21
II.3.4
CAT-ELISA
(CHLORAMPHENICOLACETYLTRANSFERASE-ENZYME-ZINFECZ
IMMUNO
SORBENT
ASSAY)
ANALYSEN
.
21
II.3
.4.1
PRAEPARATION
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
21
N.3.4.2
NACHWEIS
DES
CAT
.
22
II.3.5
PRAEPARATION
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
23
II.3.5.
1
PRAEPARATION
VON
KEMEXTRAKTEN
.
23
II.3.5.2
PRAEPARATION
VON
GESAMTZELLEXTRAKTEN
.
24
II.3.5.3
PRAEPARATION
VON
KEM
UND
CYTOSOLISCHEN
EXTRAKTEN
.
25
II.
3.5.4
PRAEPARATION
VON
MEMBRAN-,
CYTOSOLISCHEN
UND
KEMFRAKTIONEN
FUER
IN
VITRO
ANALYSEN
.
26
II.3.6
IN
VITRO
ANALYSEN
.
26
II.3.7
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
27
II.3.8
SOUTHWESTERN&NALYSE
.
28
II.3.9
IKESTERNANALYSE
.
29
II.
3.9.1
NACHWEISREAKTIONEN
DER
JPESTEMANALYSE
.
29
II.3.10
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
PROTEINANREICHERUNG
AUS
ZELLEXTRAKTEN
.
30
II.3.10.1
KOPPLUNG
DER
DS
DNA
.
30
II.3
.10.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
30
II.3.
11
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
31
II.3.
12
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
DNA
.
31
II.3.13
ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFTASSAY
(EMSA)
.
32
II.3.
14
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
.
33
II.3.14.1
ISOLIERUNG
VON
DNA
.
33
II.3.14.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
100
ML
KULTUREN
.
33
II.
3.14.1.3
ISOLIERUNG
VON
SEHR
REINER
PLASMID-DNA
AUS
100
ML
UND
500
ML
KULTUREN
FUER
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
.
34
II.3.14.2
VERDAUUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
34
II.3.
14.3
GENERIERUNG
VON
KLONIERUNGSVEKTOREN
.
35
II.3.14.4
GELELEKTROPHORESE
.
35
II.3.
14.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
35
II.3.
14.6
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
.
36
II.3.
14.7
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
36
II.3.
14.8
PRAEPARATION
GESAMTGENOMISCHER
DNA
.
37
II.3.14.9
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
38
IN.
ERGEBNISSE
.
39
M.L
NGF-ABHAENGIGE
REGULATION
DER
HUMANEN
B-POLYMERASE
.
39
III.L.L
ANALYSE
DER
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN
IN
PC12
ZELLEXTRAKTEN
ANHAND
VON
EMSA-UNTERSUCHUNGEN
.
39
III.
1.2
ANALYSE
VON
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN
IN
GEHIMEXTRAKTEN
ADULTER
UND
NEONATALER
RATTEN
.
49
III
1.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
DNA-BINDENDEN
PROTEINE
.
50
III.
1.3.1
SOUTHWESTERMNULYSEN
.
50
III.
1.3.2
UNTERSUCHUNG
EINER
MOEGLICHEN
BETEILIGUNG
DES
C-JUN
AN
PROTEINKOMPLEXEN
DIE
DAS
RRE
DER
SS-POLYMERASE
BINDEN
.
57
III.
1.4
FAKTORABHAENGIGE
AKTIVIERUNG
VON
DS
DNA-BINDENDEN
PROTEINEN
IM
ZELL
FREIEN
SYSTEM
.
58
III.
1.5
ANREICHERUNG
DER
DS
DNA-BINDENDEN
PROTEINE
UEBER
AFFINITAETSCHROMATOGRA
PHIE
.
63
III.
1.6
CHARAKTERISIERUNG
VON
PC12
ZELLEN,
DIE
DAS
PSSP2CAT-PLASMID
STABIL
INTE
GRIERT
ENTHIELTEN
.
68
III.
1.7
CHARAKTERISIERUNG
TRANSIENT
MIT
PSSP2
TRANSFIZIERTER,
AUS
DEM
ISCHIASNERV
NEONATALER
RATTEN
PRAEPARIERTER,
PRIMAERER
FIBROBLASTEN
.
71
III.2
INTERLEUKIN-1
B-ABHAENGIGE
REGULATION
DES
NERVEN
WACHSTUMSFAKTORS
.
73
III.2.
1
BESCHREIBUNG
UND
GENERIERUNG
DER
KONSTRUKTE,
DIE
FUER
PROMOTORSTUDIEN
DES
NGF
EINGESETZT
WURDEN
.
73
III.
2
2
UNTERSUCHUNG
DER
IL-1
UND
SERUMINDUZIERTEN
PROMOTORAKTIVITAET
DES
NGF
UEBER
CAT-ELISA-ANALYSEN
.
76
III.2.2.
1
UNTERSUCHUNG
VON
PRIMAEREN
RATTENFIBROBLASTEN
.
76
NI.2.2.2
UNTERSUCHUNG
STABIL
TRANSFIZIERTER
NIH
3T3
ZELLEN
.
77
HI.2.3
EINFLUSS
DES
RADIKALBILDENDEN
SYSTEMS
XANTHIN/XANTHINOXIDASE
AUF
PRIMAERE
FIBROBLASTEN
.
79
III.3
REGULATION
DER
PROMOTORAKTIVITAET
DES
NERVENWACHSTUMSFAKTORS
IN
PC12
ZELLEN
.
82
III.3.
1
GENERIERUNG
STABILER
PC12
ZELLINIEN,
DIE
NGF-PROMOTORSEQUENZEN
INTEGRIERT
ENTHALTEN
.
82
III.3.2
UNTERSUCHUNG
EINER
PUTATIVEN
AUTOKRINEN
REGULATION
DER
PROMOTORAKTIVITAET
DES
NGF
ANHAND
VON
CAT-ELISA-ANALYSEN
.
83
III.3.3
ANALYSE
DER
RADIKALABHAENGIGEN
NGF-PROMOTORREGULATION
IN
STABIL
TRANSFI
ZIERTEN
PC
12
ZELLEN
.
85
III.3.4
BETEILIGUNG
DES
RAS
AN
DER
NGF
ABHAENGIGEN
REGULATION
DES
NGF-PRO
MOTORS
.
86
M.3.5
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
GLUTAMAT
UND
CARBACHOL
AUF
DIE
NGF
PROMOTORAKTIVITAET UEBER
CAT-ELISA-ANALYSEN
.
88
IV.
DISKUSSION
.
90
IV.
1
REGULATION
DES
IM
PROMOTOR
DER
HUMANEN
FL-POLYMERASE
ENTHALTENEN
RAS
RESPONSIVE
ELEMENTS
.
90
IV.
1.1
DETEKTION
EINER
SPEZIFISCHEN
NGF-ABHAENGIGEN
REGULATION
DES
RRE
IN
PC
12
ZELLEN
.
92
IV.
1.2
NGF-INDUZIERTE
PROTEINBINDUNG
UEBER
POSTTRANSLATORISCHE
MODIFIZIERUNG
.
94
IV.
1.3
INDUKTION
DER
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNG,
EIN
NGF
-
NICHT
UEBER
CAMP
REGULIERTER
PROZESS
.
95
IV.
1.4
DISKUSSION
DER
UNTERSCHIEDLICHEN
BINDUNGSKINETIKEN
EGF-
UND
NGF-INDU
ZIERTER
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN
.
95
IV.
1.5
VERGLEICH
RRE-BINDENDER
PROTEINE
AUS
GEHIMEXTRAKTEN
NEONATALER
UND
ADULTER
RATTEN
MIT
PC
12
ZELLPROTEINEN
.
97
IV.1.6
NGF-ABHAENGIGE
REGULATION
DES
RRE
IN
ZELLFREIEN
IN
VITRO
ANALYSEN
.
98
IV.
1.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
DNA-BINDENDEN
PROTEINE
UEBER
KOMPETITIVE
EMSA
UND
SOUTHWESTEMAMLYSEN
.
99
IV.
1.8
BESTIMMUNG
DER
MOLEKULARGEWICHTE
VON
PROTEINEN,
DIE
AN
DAS
RRE
BINDEN
.
100
IV.
1.9
EXPERIMENTE
ZUR
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHEN
ANREICHERUNG
RRE-BINDEN
DER
PROTEINE
.
101
IV.
1.10
UNTERSUCHUNG
DER
REGULATION
EINES
PROMOTORFRAGMENTS
DER
HUMANEN
SS-PO
IYMERASE
IN
PC
12
ZELLEN
.
103
IV.2
IL-L-ABHAENGIGE
REGULATION
DER
NGF-PROMOTORAKTIVITAET
IN
PRIMAEREN
UND
SEKUNDAEREN
FIBROBLASTEN
.
104
IV.2.
1
ERFOLGREICHE
KLONIERUNG
DES
NGF-PROMOTORKONSTRUKTS
P-5/+128(AP-L)
.
106
IV.2.2
IL-1
UND
SERUMABHAENGIGE
REGULATION
DES
NGF
IN
TRANSIENT
UND
STABIL
TRANS
FIZIERTEN
FIBROBLASTEN
.
106
IV.2.3
EINFLUSS
VON
RADIKALEN
AUF
DIE
NGF-SYNTHESEREGULATION
.
109
1V.3
NGF-ABHAENGIGE
REGULATION
VON
NGF-PROMOTORFRAGMENTEN
IN
PC12
ZELLEN
.
110
IV.3
.1
SPEZIFISCHE
NGF-INDUZIERTE
REGULATION
VON
PROMOTORFRAGMENTEN
DES
NGF
.
111
IV.3.2
EINFLUSS
VON
RADIKALEN
AUF
DIE
NGF-PROMOTORREGULATION
.
112
IV.3.
3
RAS-ABHAENGIGE
ERHOEHUNG
DER
NGF-PROMOTORAKTIVITAET
.
112
IV.3.4
WIRKUNG
VON
GLUTAMAT
UND
CARBACHOL
AUF
DIE
REGULATION
DER
NGF-SYNTHESE.
113
IV.3.
5
AUSWAHL
EINES
PRIMAERKULTURSYSTEMS
ZUR
ANALYSE
AUTOKRINER
UND
PARAKRINER
NGF-REGULATIONSMECHANISMEN
.
114
V.
ZUSAMMENFASSUNG
.
116
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
.
119
VII.
ANHANG
.
132
VII.
1
NACHWEIS
VON
RNA
MIT
NORTFCERNANALYSEN
.
132
VII.
1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
132
VII.
1.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
133
VH.1.3
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
UEBER
DENATURIERENDE
GELE
.
133
VII.
1.4
IMMOBILISIERUNG
VON
RNA
AN
NYLONMEMBRANEN
.
134
VII.
1.5
HYBRIDISIERUNG
UND
NICHTRADIOAKTIVER
NACHWEIS
VON
RNA
.
134
VII.2
PRAEPARATION
UND
KULTIVIERUNG
VON
KOERNERZELLEN
AUS
DEM
ZEREBELLUM
PRAENATALER
RATTEN
.
136
VII.3
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
UND
TABELLEN
.
138 |
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