Untersuchungen zur funktionellen Kompatibilität von Connexin Halbkanälen mittels gezielter Mutationen:
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| Format: | Buch |
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1996
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| Beschreibung: | Bonn, Univ., Diss., 1996 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.1
1.1 AUFBAU UND VORKOMMEN VON GAP JUNCTIONS.1
1.2 DIE MULTIGENFAMILIE DER CONNEXINE.2
1.3 TOPOLOGIE DER CONNEXINE.3
1.4 FUNKTION DER GAP JUNCTIONS.6
1.5 REGULATION DER GAP JUNCTION-VERMITTELTEN KOPPLUNG.7
1.6 INTERZELLULAERE KOMMUNIKATION UEBER GAP JUNCTIONS.10
1.7 ZIELE DIESER ARBEIT.12
2. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS. 14
3. MATERIAL. 16
3.1 CHEMIKALIEN.16
3.2 ALLGEMEINE PUFFER UND LOESUNGEN.16
3.3 MEDIEN FUER DIE BAKTERIENKULTUR.17
3.4 BAKTERIENSTAEMME.18
3.5 BAKTERIOPHAGEN.19
3.6 PLASMIDE UND PLASMIDKONSTRUKTE.19
3.6.1 KLONIERUNGSVEKTOREN.19
3.6.2 REKOMBINANTE PLASMIDE.21
3.7 OLIGONUKLEOTIDE.21
3.7.1 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE GEZIELTE MUTAGENESE.21
3.7.2 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE SEQUENZIERUNG.21
3.8 HYBRIDISIERUNGSSONDEN.22
3.9 MEDIEN UND LOESUNGEN FUER DIE ZELLKULTUR.22
3.10 ANTIKOERPER.23
-I-
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4. METHODEN. 24
4.1 DNS-PRAEPARATIONEN.24
4.1.1 ANALYTISCHE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNS (MINIPRAEPARATION).24
4.1.2 PRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNS (MIDIPRAEPARATION).24
4.1.3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNS.25
4.1.4 ISOLIERUNG VON DNS-FRAGMENTEN.25
4.1.5 ISOLIERUNG KLEINER PCR-FRAGMENTE.26
4.1.6 HERSTELLUNG VON EINZELSTRANG-DNS.26
4.2 RNS-PRAEPARATION.26
4.3 ELEKTROPHORESE.27
4.3.1 NATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.27
4.3.2 DENATURIERENDE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.27
4.3.3 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.28
4.3.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 28
4.4 ENZYMATISCHE DNS-MODIFIKATIONEN.29
4.4.1 RESTRIKTIONSSPALTUNGEN.29
4.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNS-ENDEN.29
4.4.3 DNS-LIGATION.29
4.5 KOMPETENTE BAKTERIEN UND TRANSFORMATION.30
4.6
IN VITRO-MUTAGENESE.30
4.6.1
STICKY FEET DIRECTED MUTAGENESE.30
4.6.2
HETERO GAPPED DUPLEX MUTAGENESE.34
4.7 TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN UND PROTEINEN AUF MEMBRANEN.35
4.7.1 NORTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG.35
4.7.2 WESTERN BLOT-HYBRIDISIERUNG.36
4.8 TRANSFEKTION VON ADHAERENTEN SAEUGERZELLEN.37
4.9 HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN UND PROTEINBESTIMMUNG.37
4.10 IMMUNFLUORESZENZ UND DOPPELIMMUNFLUORESZENZ.38
4.11 MIKROINJEKTION VON KULTURZELLEN.38
4.11.1 HOMOLOGE KOPPLUNG.39
4.11.2 HETEROLOGE KOPPLUNG.40
4.12 ELEKTRISCHE MESSUNGEN.40
4.13 ELEKTRONENMIKROSKOPIE.40
-II-
INHALTSVERZEICHNIS
5. ERGEBNISSE.41
5.1 HERSTELLUNG CHIMAERER CX40/CX43-GENE.41
5.1.1 HERSTELLUNG DER CX40*43C2-CHIMAERE.42
5.1.2 HERSTELLUNG DER CX40*43C3-CHIMAERE.43
5.1.3 HERSTELLUNG DER CX40*43C2,3-CHIMAERE.:.44
5.1.4 HERSTELLUNG DER CX40*43C2-3-CHIMAERE.44
5.1.5 HERSTELLUNG DER CX40*43E2,C2-CHIMAERE.45
5.1.6 HERSTELLUNG DER CX40*43EL,2,C2-CHIMAERE.45
5.2 EXPRESSION DER CHIMAEREN CX40/CX43 GENPRODUKTE IN HELA-ZELLEN.45
5.2.1 TRANSFEKTION DER CHIMAEREN IN HELA-ZELLEN.46
5.2.2 NORTHERN BLOT ANALYSEN. 46
5.2.3 IMMUNOBLOT-ANALYSEN.47
5.2.4 IMMUNFLUORESZENZ-UNTERSUCHUNGEN.49
5.2.5 UEBERTRAGUNG VON LUCIFER YELLOW UND NEUROBIOTIN.52
5.3 ANALYSEN DER BILDUNG HETEROTYPISCHER GAP JUNCTIONS.54
5.3.1 DOPPELIMMUNFLUORESZENZ-UNTERSUCHUNGEN.54
5.3.2 HETEROLOGE KOPPLUNGSMESSUNGEN.57
5.4 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN.58
5.5 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN.61
5.6 TRANSDOMINANT NEGATIVE PUNKTMUTANTEN.62
5.6.1 HERSTELLUNG DER CX26/143-PUNKTMUTANTE.62
5.6.2 HERSTELLUNG DER CX26/216-PUNKTMUTANTE. 64
5.7 EXPRESSION DER CX26-PUNKTMUTANTEN IN HELA-ZELLEN.65
5.7.1 TRANSFEKTION IN HELA-ZELLEN.65
5.7.2 IMMUNOBLOT-ANALYSEN.65
5.7.3 IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSEN DER CX26-PUNKTMUTANTEN.67
5.7.4 MIKROINJEKTIONEN MIT NEUROBIOTIN.70
5.8 CX30.3-, CX31.1-, CX46- UND CX50-TRANSFEKTANTEN.71
-III-
INHALTSVERZEICHNIS
6. DISKUSSION.74
6.1 INKOMPATIBILITAET VON CX40 UND CX43.74
6.1.1 ZUR AUSWAHL DER MUTAGENESEMETHODE FUER DIE HERSTELLUNG CHIMAERER
CONNEXINE 75
6.1.2 EXPRESSION UND FUNKTION DER CHIMAEREN CX40/CX43-PROTEINE.76
6.2 UNTERSUCHUNG TRANSDOMINANT NEGATIVER EFFEKTE VON
CX26-PUNKTMUTANTEN.80
6.2.1 EFFEKTE DER CX26/143-MUTANTE.80
6.2.2 EFFEKTE DER CX26/216-MUTANTE.82
6.3 KOPPLUNGSSTUDIEN VERSCHIEDENER HAUT- UND LINSEN-CONNEXINE.83
6.3.1 CONNEXINE DER HAUT: CX30.3 UND CX31.1.83
6.3.2 CONNEXINE DER LINSE: CX46 UND CX50.84
6.4 AUSBLICK. 85
7
.
ZUSAMMENFASSUNG.
.
87
8
.
LITERATURVERZEICHNIS.89
9
.
ANHANG.98
-IV- |
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