Die gruppenspezifische Komponente, Vitamin-D-bindendes Protein des Menschen: molekularbiologische Untersuchungen zur Variabilität, funktionale Analyse der Protein-Domänen
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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I
NHALTS
V
ERZEICHNIS
I
I
NHALTSVERZEICHNIS
A
E
INLEITUNG
.
1
1
ENTDECKUNG,
POLYMORPHISMUS
UND
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
GRUPPENSPEZIFISCHEN
KOMPONENTE/VITAMIN
D
BINDENDES
PROTEIN
.
1
2
SYNTHESE
UND
FUNKTION
.
2
3
ALBUMIN/ALPHAFETOPROTEIN/GRUPPENSPEZIFISCHE
KOMPONENTE-GENFAMILIE.
5
3.1
VERWANDTSCHAFT
ZU
SERUM
ALBUMIN
UND
ALPHAFETOPROTEIN
.
5
3.2
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
.
10
3.3
MOLEKULARBIOLOGIE
DES
GC
.
12
4
VERGLEICH
VON
GC/DBP
VON
MENSCH,
RATTE
UND
MAUS
.
16
5
VORKOMMEN
VON
GC/DBP
IM
TIERREICH
.
16
6
POLYMORPHISMUS
UND
VARIABILITAET
IM
GC/DBP-SYSTEM:
DETEKTION,
GEOGRAPHISCHE
VERTEILUNG
UND
ANWENDUNG
.
17
7
REKOMBINANTE
GENEXPRESSION
.
22
7.1
EINFUEHRUNG
.
22
7.2
DAS
BACULOVIRUS-SYSTEM
ZUR
HETEROLOGEN
GENEXPRESSION
.
24
B
Z
IELSETZUNG
.
31
C
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
.
32
1
MATERIAL
.
32
1.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
32
1.2
DNA-LAENGENSTANDARDS
UND
PROTEIN-MOLEKULARGEWICHTSMARKER
.
32
1.3
OLIGONUKLEOTIDE
.
32
1.4
BAKTERIEN
UND
VEKTOREN
.
33
1.5
PUFFER,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
33
1.6
HERKUNFT
VON
BLUTPROBEN,
BZW.
GENOMISCHER
DNA
VON
GC
VARIANTEN
.
37
I
NHALTS
V
ERZEICHNIS
II
2
METHODEN
.
38
2.1
ETABLIERTE
METHODEN
.
38
T
EIL
I:
Z
UR
MOLRKULAREN
A
NALYSE
DER
V
ARIABILITAET
DES
HUMANEN
GC/DBP
G
ENS
2.2
GC
TYPISIERUNG
DURCH
PAGIEF
UND
IMMUNOPRINT
.
39
2.2.1
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
39
2.2.2
IMMUNOPRINT
.
40
2.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
VOLLBLUT
.
40
2.4
PCR-AMPLIFIKATION
DER
KODIERENDEN
EXONS
DES
HGC
GENS
.
42
2.5
SSCP-ANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
.
44
2.6
SCHNELLE
SILBERFAERBUNG
VON
DNA-POLYACRYLAMIDGELEN
.
46
2.7
KLONIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
ZUR
SEQUENZANALYSE
.
46
2.7.1
LIGATION
IN
PLASMIDVEKTOREN
.
47
2.7.1.
1
BLUNT
END
LIGATION
.
47
2.7.1.2
LIGATION
IN
EINEN
T-VEKTOR
.
47
2.7.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
49
2.7.3
TRANSFORMATION
.
50
2.7.4
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IM
'
BATCH
'
-VERFAHREN
.
50
2.7.5
SEQUENZANALYSE
DER
KLONIERTEN
PCR-PRODUKTE
.
51
2.7.6
DETEKTION
EINZELNER
REKOMBINANTER
KLONE
.
52
2.7.6.1
KOLONIEBLOT
UND
HYBRIDISIERUNG
EINER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDE
.52
2.7.6.2
BLAU/WEISS-SELEKTION
.
54
2.7.6.3
BAKTERIEN-PCR
.
55
2.8
HAPLOTYP-ANALYSE
DER VARIANTE
1A1
.
55
2.8.1
ANALYSE
DES
VARIABLEN
3
'
ENDES
DES
ALU-ELEMENTS
(ALUVPA)
IM
INTRON
8
DES
GC
GENS
.
56
2.8.2
ANALYSE
DES
C-23-T
POLYMORPHISMUS
IM
5
'
UNTRANSLATIERTEN
BEREICH
VON
EXON
1
DES
HUMANAN
GC
GENS
.
56
2.9
ANALYSE
DER
'
PSEUDO
'
STUMMEN
VARIANTE
GC*
1'
.
57
INHALTSVERZEICHNIS
JJJ
2.9.1
PCR-AMPLIFIKATION
DES
UNTRANSLATIERTEN
EXON
13
DES
GC
GENS
.
57
2.9.2
PCR-AMPLIFIKATION
EINES
TEILBEREICHS
DER
5
'
REGULATORISCHEN
REGION
.
58
2.9.3
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
58
2.10
ARMS
ZUR
SCHNELLEN
ANALYSE
DER
DREI
HAEUFIGEN
GC
ALLELE
.
60
T
EIL
II:
R
EKOMBINANTE
E
XPRESSION
DES
HUMANEN
GC/DBPS
UND
SEINER
DREI
D
OMAENEN
:
E
INE
A
NALYSE
ZUR
V
ITAMIN
D
UND
A
KTIN
-
BINDUNG
2.11
RNA-ISOLIERUNG
AUS
LEBERGEWEBE
.
62
2.12
ERSTSTRANG-CDNA-SYNTHESE
UND
RT-PCR
.
63
2.12.1
CDNA-SYNTHESE
MITTELS
REVERSER
TRANSKRIPTION
.
63
2.12.2
RT-PCR
.
64
2.13
UMKLONIERUNG
DER
GC/DBP
SEQUENZEN
IN
BACULOVIRUS-TRANSFERVEKTOREN.66
2.13.1
BACULOVIRUS-TRANSFERVEKTOREN
.
66
2.13.2
PRAEPARATION
DER
GC/DBP
INSERTS
.
69
2.14
KULTIVIERUNG
VON
INSEKTENZELLEN
.
70
2.14.1
INSEKTENZELLINIEN
.
70
2.14.2
AUFIAUEN,
SUBKULTIVIEREN
UND
EINFRIEREN
.
71
2.15
GENERIERUNG
UND
AMPLIFIKATION
VON
REKOMBINANTEN
BACULOVIREN
.
71
2.15.1
KOTRANSFEKTION
VON
REKOMBINANTEM
TRANSFERPLASMID
UND
VIRUS-DNA
.
71
2.15.2
VIRUS-AMPLIFIKATION
.
73
2.16
PCR-ANALYSE
ZUM
NACHWEIS
REKOMBINANTER
VIREN
.
74
2.17
ACETONFAELLUNG
VON
PROTEINEN
.
76
2.18
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
76
2.19
WESTERN
BLOTTING
.
78
2.20
IMMUNOBLOTTING
.
79
2.21
EXPRESSION
DER
HETEROLOGEN
PROTEINE
.
80
2.22
DIALYSE
UND
KONZENTRIERUNG
DER
PROTEINHALTIGEN KULTURUEBERSTAENDE
.
80
2.23
DARSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
MITTELS
IEF
.
81
2.24
BINDUNG
VON
VITAMIN
DJ
.
82
2.25
BINDUNG
VON
AKTIN
.
82
I
NHALTSVERZEICHNIS
IV
2.26
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEIN-POLYACRYLAMIDGELEN
.
83
D
E
RGEBNISSE
_
_
84
T
EIL
I
Z
UR
MOLEKULAREN
A
NALYSE
DER
V
ARIABILITAET
DES
HUMANEN
GC/DBP
G
ENS
1.1
EXON-AMPLIFIKATION
DER
KODIERENDEN
EXONS
DER
GC
VARIANTEN
MITTELS
PCR
.
84
1.2
SSCP-ANALYSE
DER
EXON-AMPLIFIKATE
.
85
1.3
SEQUENZANALYSE
DER GC
VARIANTEN
.
87
1.3.1
BESCHREIBUNG
DER
NUKLEOTID
UND
AMINOSAEURESUBSTITUTIONEN
.
87
1.3.2
BESTAETIGUNG
VON
DNA-SEQUENZIERDATEN
DURCH
RESTRIKTIONSANALYSE
.
91
1.3.3
CHARAKTERISIERUNG DER
NUKLEOTIDSUBSTITUTIONEN
.
94
1.3.4
KORRELATION
VON
DNA-SEQUENZANALYSE
UND
LEF/PAGE-DATEN
.
95
1.3.5
VERTEILUNG
DER
AMINOSAERESUBSTITUTIONEN
.
95
1.4
ANALYSE
DER
'
PSEUDO
'
STUNUNEN
VARIANTE
GC
1
'
.
100
1.5
HAPLOTYP-ANALYSE
DER
VARIANTE
1
AL
.
101
1.5.1
ANALYSE
DES
VARIABLEN
3
'
ENDES
DES
ALU-REPEATS
IN
INTRON
8
(GC-I8
ALUVPA)
.
102
1.5.2
C-T-23
POLYMORPHISMUS-ANALYSE
.
103
1.5.3
EXON
8
GC-283.3
POLYMORPHISMUS-ANALYSE
.
104
1.6
ERGEBNISSE
DER
ALLELSPEZIFISCHEN
PCR
.105
T
EIL
II
R
EKOMBINANTE
E
XPRESSION
DES
HUMANEN
GC/DBP
S
UND
SEINER
DREI
D
OMAENEN
:
E
INE
A
NALYSE
ZUR
V
ITAMIN
D
UND
A
KTIN
-
BINDUNG
2.1
HERSTELLUNG
GC/DBP-SPEZIFISCHER
CDNA-AMPLIFIKATE
.108
2.2
EXPRESSION
DER
GC/DBP-SEQUENZEN
IM
BACULOVIRUS-SYSTEM
.
110
2.2.1
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
TRANSFERVEKTOREN
.110
2.2.2
PRODUKTION
UND
AMPLIFIKATION
REKOMBINANTER
VIREN
.
111
I
NHALTSVERZEICHNIS
V
2.2.3
EXPRESSION
DER
HETEROLOGEN
PROTEINE
.
116
2.3
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
.118
2.3.1
DARSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
MITTELS
IEF
BAND
SHIFT
ASSAY
ZUM
NACHWEIS
DER
VITAMIN
DJ-BINDUNG
.118
2.3.2
DARSTELLUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
MITTELS
NATIVER
PAGE
BAND
SHIFT
ASSAY
ZUM
NACHWEIS
DER
AKTIN-BINDUNG
.
123
E
D
ISKUSSION
.
128
1
DIE
GRUPPENSPEZIFISCHEKOMPONENTE/VITAMIN
D-BINDENDES
PROTEIN
DES
MENSCHEN
-
HOCHKONSERVIERT
UND
HOCHVARIABEL
.
128
2
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
PROTEIN-DOMAENEN
DES
VITAMIN
D-BINDENDEN
PROTEINS
.
145
F
Z
USAMMENFASSUNG
DER
E
RGEBNISSE
.
155
G
L
ITERATURVERZEICHNIS
.158
PUBUKATIONSLISTE
.
178
D
ANKSAGUNG
.179
L
EBENSLAUF
.
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