Funktionelle Charakterisierung eines Guanylatzyklase-aktivierenden Proteins aus Photorezeptorzellen von Wirbeltieren:
Gespeichert in:
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| Sprache: | German |
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1.0
EINLEITUNG
1
1.1
DIE
VERARBEITUNG
VON
LICHTIMPULSEN
IN
DER
NETZHAUT
1
1.2
DER
AUFBAU
DER
PHOTOREZEPTOREN
2
1.3
DIE
LONENTRANSPORTPROZESSE
IM
PHOTOREZEPTOR
3
1.4
DIE
CGMP-KASKADE
4
1.5
DIE
WIEDERHERSTELLUNG
DES
DUNKELZUSTANDES
5
1.6
DIE
ABSCHALTUNG
DER
KASKADE
5
1.7
DIE
LICHT-ADAPTATION
5
1.8
DIE
SYNTHESE
VON
CGMP
DURCH
EINE
RETINALE,
MEMBRANSTAENDIGE
GUANYLATZYKLASE
6
1.9
DIE
REGULATION
DER
RETGC
DURCH
DIE
FREIE
CALCIUM-KONZENTRATION
7
1.10
GC
API,
EIN
GUANYLATZYKLASE-AKTIVIERENDES
CALCIUMBINDUNGSPROTEIN
8
1.11
AKTIVIERUNG
DER
RETGC
DURCH
EINEN
NICHT-GCAP-VERWANDTEN
FAKTOR
8
1.12
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
9
2.0
MATERIAL
&
METHODEN
10
2.1
VERWENDETE
CHEMIKALIEN
UND
MATERIALIEN
10
2.2
PRAEPARATION
DER
SEHSTAEBCHENAUSSENSEGMENTE
10
2.3
BESTIMMUNG
DER
RHODOPSINKONZENTRATION
11
2.4
REINIGUNG
VON
GCAP1
AUS
ROS
12
2.4.1
HERSTELLUNG
EINES
LICHTEXTRAKTES
12
2.4.2
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
12
2.4.3
MONOQ-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
12
2.5
KLONIERUNG
VON
GCAP1
13
2.5.1
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
13
2.5.2
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
14
2.5.2.1
KULTURBEDINGUNGEN
DER
EXPRESSIONSKULTUREN
14
2.5.2.2
INFEKTION
DER
E.
CO/Z-ZELLEN
MIT
%-PHAGEN
14
2.5.3
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
15
2.5.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
15
2.5.4.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
15
2.5.4.2
ETHIDIUMBROMID-FLUORESZENZ
16
2.5.5
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
16
2.5.5.1
ALKALISCHE
MINI-PRAEPARATION
16
2.5.5.2
ALKALISCHE
MAXI-PRAEPARATION
17
2.5.6
MODIFIKATION
VON
NUKLEINSAEUREN
17
2.5.6.1
GLAETTEN
UEBERHAENGENDER
ENDEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
17
2.5.OE.2
PHOSPHORYLIERUNG
DER
5
'
-ENDEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
17
2.5.63
DEPHOSPHORYLIERUNG
GESCHNITTENER
VEKTOREN
18
2.5.7
ANALYSE
VON
DNA
18
2.5.7.1
RESTRIKTION
VON
DNA
18
2.5.7.2
DNA-SEQUENZIERUNG
19
2.5.73
GELELEKTROPHORESE
19
2.5.8
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
20
2.5.9
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
20
2.5.9.1
LIGATION
20
2.5.9.2
TRANSFORMATION
20
2.5.93
SUBKLONIERUNG
VON
CDNA
AUS
X-PHAGEN
21
2.5.10
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
21
2.5.11
MARKIEREN
VON
NUKLEINSAEUREN
22
2.5.12
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEUREN
23
2.5.12.1
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
23
2.5.12.2
HYBRIDISIERUNG
23
2.5.12.3
DETEKTION
MARKIERTER
NUKLEINSAEUREN
24
2.6
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
GCAP1-FORMEN
24
2.6.1
GLUTATHIONAGAROSE-CHROMATOGRAPHIE
25
2.6.2
THROMBINSPALTUNG
25
2.6.3
MONOQ-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
25
2.7
ANTIKOERPER-PRODUKTION
26
2.8
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
26
2.9
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
27
2.9.1
DURCHFUEHRUNG
DER
SDS-PAGE
27
2.10
FAERBUNG
DER
MINIGELE
MIT
COOMASSIE-BLUE
28
2.11
WESTEM-BLOTTING
29
N
2.12
IMMUNODETEKTION
29
2.13
AMIDOSCHWARZFAERBUNG
VON
BLOTMEMBRANEN
30
2.14
IMMUNHISTOCHEMIE
31
2.15
MESSUNG
DER
RETGC-AKTIVITAET
31
2.16
REKONSTITUTIONSEXPERIMENTE
MIT
OKADASAEURE
32
2.17
CALCIUM-PUFFER
32
2.18
MEMBRAN-BINDUNGSSTUDIEN
33
2.19
45
CALCIUM
AUTORADIOGRAPHIE
33
3.0
ERGEBNISSE
34
3.1
IDENTIFIZIERUNG
UND
REINIGUNGVON
GCAP1
34
3.1.1
HERSTELLUNG
EINES
LICHTEXTRAKTES
34
3.1.2
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
34
3.1.3
MONOQ-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
34
3.2
CALCIUMBINDUNG
VON
GCAP1
37
3.2.1
CALCIUM-ABHAENGIGE
VERSCHIEBUNG
IM
SDS-GEL
37
3.2.2
NACHWEIS
DER
CALCIUMBINDUNG
MIT
45
CALCIUM
37
3.3
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
VERWANDTSCHAFTSVERHAELTNISSE
37
3.4
BESTIMMUNG
DER
RETGC-AKTIVITAET
38
3.4.1
BASALAKTIVITAET
DER
GEWASCHENEN
MEMBRANEN
38
3.4.2
EINSTELLUNG
DER
OPTIMALEN
K
+
-KONZENTRATION
FUER
DIE
REKONSTITUTIONSEXPERIMENTE
38
3.5
CALCIUM-ABHAENGIGE
AKTIVIERUNG
DER
RETGC
DURCH
GCAP1
38
3.6
ATP-ABHAENGIGKEIT
DER
RETGC-AKTIVIERUNG
39
3.7
KLONIERUNG
VON
GCAP1
42
3.7.1
PARTIELLE
SEQUENZIERUNG
VON
GCAP1
42
3.7.2
PCR
AUF
RINDERRETINA-SPEZIFISCHER
CDNA
43
3.7.3
ISOLIERUNG
VON
CDNA-MOLEKUELEN
44
3.8
DIE
PRIMAERSTRUKTUR
VON
GCAPI
47
3.9
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
GC
API-FORMEN
47
3.9.1
HERSTELLUNG
VON
EXPRESSIONSKLONEN
49
3.9.2
OPTIMIERUNG
DER
EXPRESSIONSBEDINGUNGEN
49
3.9.3
AFFINITAETSREINIGUNG
UEBER
GLUTATHION-AGAROSE
49
3.9.4
MONOQ-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
49
3.10
EIGENSCHAFTEN
DES
REKOMBINANTEN
GCAP1
IM
VERGLEICH
ZUM
NATIVEN
GCAP1
51
M
3.10.1
CALCIUM-ABHAENGIGE
VERSCHIEBUNG
DES
NATIVEN
UND
DES
REKOMBINANTEN
GCAP
IM
SDS-GEL
51
3.10.2
TITRATION
DER
CALCIUM-ABHAENGIGEN
VERSCHIEBUNG
IM
SDS-GEL
52
3.10.3
CALCIUM-ABHAENGIGE
AKTIVIERUNG
DER
RETGC
DURCH
NATIVES
UND
REKOMBINANTES
GCAP1
53
3.10.4
VERHAELTNIS
VON
NATIVEM
UND
REKOMBINANTEM
GCAP
ZU
RHODOPSIN
IN
DEN
REKONSTITUTIONSEXPERIMENTEN
55
3.10.5
ATP-ABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVIERUNG
DER
RETGC
DURCH
NATIVES
UND
REKOMBINANTES
GCAP1
56
3.11
IMMUNREAKTIVITAET
DES
ANTI-GCAP
1
-ANTIKOERPERS
58
3.12
IMMUNHISTOCHEMIE
58
3.13
GCAP
1
-KONZENTRATION
IN
DEN
ROS-PRAEPARATIONEN
59
3.14
GCAP
1
-GEHALT
DES
ROS-GRADIENTEN
60
4.0
DISKUSSION
62
4.1
DIE
AKTIVIERUNG
DER
RETGC
DURCH
NATIVES
GCAP1
62
4.2
DIE
ROLLE
VON
ATP
BEI
DER
RETGC-AKTIVIERUNG
64
4.3
DIE
CALCIUMBINDUNG
VON
GCAP1
65
4.4
DIE
STELLUNG
DER
GCAPS
INNERHALB
DER
FAMILIE
DER
EF-HAND
CALCIUMBINDUNGSPROTEINE
67
4.5
DIE
CHEMISCHEN
UND
STRUKTURELLEN
EIGENSCHAFTEN
VON
GCAP1
67
4.6
FUNKTIONELLE
EXPRESSION
REKOMBINANTER
GC
API
-FORMEN
68
4.7
EIN
VERGLEICH
DER
EIGENSCHAFTEN
VON
NATIVEM
GCAP1
MIT
DEN
REKOMBINANTEN
FORMEN
69
4.8
DAS
VORKOMMEN
VON
GCAP1
IN
DER
RETINA
70
4.9
AUSBLICK
71
5.0
ZUSAMMENFASSUNG
73
6.0
LITERATUR
74
7.0
ANHANG
85
IV |
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| topic_facet | Aktivatorproteine Guanylatcyclase Photorezeptor Hochschulschrift |
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