Rekombinante Expression und Charakterisierung der potentiellen RNA-Polymerase des Hepatitis-A-Virus:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1995
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A.
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
I.
EINLEITUNG
I
I
1
GESCHICHTE,
EPIDEMIOLOGIE
UND
KLINISCHES
BILD
DER
HEPATITIS
A
1
I
2
KLASSIFIZIERUNG
UND
EIGENSCHAFTEN
DES
HEPATITIS-A-VIRUS
3
I
3
GENOMORGANISATION
DES
HEPATITIS-A-VIRUS
3
I
4
REPLIKATIONSZYKLUS
DER
P
'
COMAVIREN
AM
BEISPIEL
DES
POLIOVIRUS
5
I
5
GEGENWAERTIGE
MODELLE
FUER
DIE
INITIATION
DER
PLUS-STRANG
RNA-SYNTHESE
7
DES
POLIOVIRUS
11.
ZIEL
DER
ARBEIT
9
III.
MATERIAL
UND
METHODEN
10
1111
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
10
III
11
CHEMIKALIEN
10
ILL
1
2
ENZYME
11
III
1
3
MARKERPROTEINE
II
III
1
4
VERBRAUCHSMATERIALIEN
12
1112
GERATE
12
1113
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
12
III
3
1
BAKTERIEN
12
III
3.1
I
BAKTERIENWACHSTUM,
MEDIEN
UND
STAMMHALTUNG
13
III
3
1
2
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIENZELLEN
NACH
14
HANAHAN
(1983)
III
3
1
3
TRANSFORMATION
14
III
3
2
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
15
1114
PRAPARATION
UND
ANALYTIK
VON
NUKLEINSAEUREN
16
III
4
1
ALLGEMEINE
TECHNIKEN
16
III
4
1
1
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOIFALLUNG
16
III
4
1
2.
REINHEITS-UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
16
NUKLEINSAEUREN
1114
2
PRAPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
17
III
4
3
AGAROSE-GEIELEKTROPHORESE
VON
DNA
17
UL
4
4
ENZYMATISCHE
TECHNIKEN
FUER
DIE
IN
VITRO
REKOMBINATION
VON
17
DNA
III
4
4
I
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
DNA
17
III
4
4
1
1
REINIGUNG
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
AUS
DEM
18
AGAROSEGEL
MIT
SPINBIND*
III
4
4
2.
ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
DNA-ENDEN
18
III
4
4
2
1
ABDAUEN
VON
3
'-UEBERSTEHENDEN
ENDEN
MIT
DER
"MUNG
18
BEAN"-NUKLEASE
III
4
4
2
2
LIGATION
MIT
T4
DNA-LIGASE
19
III
4
5
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRANGIGER
PLASMID-DNA
NACH
DER
19
KETTENABBRUCHMETHODE
MIT
DDNTP'S
(SANGER
ET
AL,
1977)
III
4
6
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
DNA
DURCH
DIE
POLYMERASE
20
KETTENREAKTION
(POLYMERASE
CHAM
REACTION,
PCR,
VERAENDERT
NACH
GELFAND,
1990)
111
4
6
1
AUFBEREITUNG
DER
"PRIMER"
21
III
4
6
2
DIE
ZUSAMMENSETZUNG
DER
PCR-REAKTION
21
III
4
6
3
DIE
HEIZZYKLEN
WAEHREND
DER
PCR-REAKTION
21
III
4
7
REINIGUNG
DER
DURCH
DIE
PCR
AMPLIFIZIERTEN
UND
MIT
NHE
I
UND
22
HIND
III
GESCHNITTENEN
FUER
3D
KODIERENDEN
DNA-SEQUENZEN
III
4
7
1
HERSTELLEN
EINER
S-300
SAEULE
22
III
4
7
2
REINIGEN
VON
RESTRINGIERTEN
3D
AMPLIFIKATIONSPRODUKTEN
22
III
5
PRAEPARATION
UND
ANALYTIK
VON
PROTEINEN
23
1115
0
1
EINDIMENSIONALE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
VON
23
PROTEINEN
III
5
0
1
1
PRAPARATION
VON
DENATURIERENDEN
SDS-GELEN
(NACH
23
HAMES
UND
RICKWOOD,
1981)
III
5
0
2
VERTIKALE,
DENATURIERENDE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTRO
24
PHORESE
(NACH
LAMMLI,
1970,
VERAENDERT)
III
5
1
AUFARBEITUNG
VON
DENATURIERENDEN
SDS-POLYACRYLAMID
24
PROTEINGELEN
NACH
DEM
LAUF
III
5
1
1
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
(VERAENDERT
NACH
24
SAMBROOK
ET
AL
,
1989)
III
5
1
2
VORBEREITUNG
FUER
DIE
AUTORADIOGRAPHIE
"
S-METHIONIN
25
MARKIERTER
GELE
III
5
1
3
IMMUNOBLOT
(
WESTEMBLOT)
25
III
5
1
3
1
TRANSFER
DER
PROTEINE
AUF
NITROCELLULOSEMEMBRAN
25
(VERAENDERT
NACH
TOWBIN
ET
AL
,1979,
UND
DER
ARBEITSANLEITUNG
DER
FIRMA
PHASE)
III
5
I
3
2
PONCEAU-S-FAERBUNG
VON
TRANSFERIERTEN
PROTEINEN
25
III
5
1
3
3
INKUBATION
MIT
ANTISEREN
UND
FAERBUNG
MIT
HILFE
DER
26
ALKALISCHEN
PHOSPHATASE
(AP-FAERBUNG)
III
5
1
3
4
ENTFERNUNG
BEIDER
ANTIKOERPER
ZUR
ERNEUTEN
FAERBUNG
27
EINER
MEMBRAN
MIT
EINEM
ZWEITEN
DETEKTIONSSYSTEM
III
5
1
3
5
FAERBUNG
MIT
DEM
ECL
IM
WESTERN
BLOTTING
27
DETEKTIONSSYSTEM
1116
M
VITRO
SYNTHESE
VON
PROTEINEN
IM
RETIKULOZYTENLYSAT
28
III
7
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
IN
ESCHERICHIA
COH
29
III
7
1
HERSTELLUNG
EINES
GLYCETOLSTOCKES
MDUZIERBARER
BAKTERIEN
29
(ROSENBERG
ET
AL
,
1987)
III
7
2
INDUKTION
DER
EXPRESSION
30
III
7
2
I
PRAEPARATION
EINES
GROBEN
EXTRAKTS
INDUZIERTER
30
BAKTENENZELLEN
III
7
3
MEDIUMEINFLUSS
AUF
DIE
PLASMIDSTABILITAT
VON
TRANSFORMIERTEN
31
ZELLEN
III
7
4
EXPRESSION
UND
MARKIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
MIT
31
"
S-METHIONIN
III
7
4
1
HERSTELLUNG
EINES
M9-METHIONINMANGELMEDIUMS
(MANIATIS,
32
T,
AND
J
SAM
BROOK,
1989)
III
7
4
2
HALBWERTSZETTBESTIMMUNG
DES
REKOMBINANTEN
PROTEIN
3D*
32
III
7
4
3
MESSUNG
DER
BAKTERIELLEN
MEMBRANPERMEABIBTAET
MIT
HILFE
33
DES
SS-GALACTOSIDASE-ASSAY
IV.
ERGEBNISSE
35
IV
1
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
PET-3D
UND
PET-3D*
35
IV
1
1
SEQUENZIERUNG
UND
M
VITRO
TRANSKRIPTION
UND
TRANSLATION
37
(TNTYY)
VON
PET-3D
UND
PET-3D*
IV
2
EXPRESSION
VON
PET-3D
UND
PET-3D*
IN
E
COLI
39
IV
2
1
DARSTELLUNG
DER
EXPRESSIONSPRODUKTE
VON
PET-3D
UND
39
PET-3D*
IN
EINEM
COOMASSIEBLAU-GEFARBTEN
GEL
IV
2
2
IMMUNOBLOT
VON
EXTRAKTEN
MIT
DEN
VEKTOREN
PET-3D
UND
41
PET-3D*
TRANSFORMIERTER
ZELLEN
IV
3
VERSUCHE
ZUR
STEIGERUNG
DER
EXPRESSIONSRATEN
43
IV
3
1
EXPRESSION
VON
PET-3D*
BEI
37C
UND
25C
43
INKUBATIONSTEMPERATUR
UND
VERGLEICH
MIT
DEN
EXPRESSIONSPRODUKTEN
DER
3C-MUTANTEN
PET-3CDP,
PET-3CD
A
P
IV
3
2
ERHOEHUNG
DER
DAS
ZIELPLASMID
TRAGENDEN
ZELLFRAKTION
UND
45
TESTUNG
DER
PLASMIDSTABILITAT
IV
3
3
EINFLUSS
DES
MEDIUMS
AUF
DIE
PLASMIDSTABILITAT
VON
PET-3D*
46
TRANSFORMANTEN
IV
4
RADIOAKTIVE
EXPRESSIONSKINETIK
DES
HAV-FUNKTIONSPROTEINS
3D
BZW
47
3D*
IN
DEN
E.
COLI
STAEMMEN
BL2I(DE3)
UND
BL21(DE3)PLYSS
IV
4
1
AUSWIRKUNGEN
DER
EXPRESSION
DER
HAV-PROTEINE
3D
BZW.
53
3D*
AUF
DIE
MEMBRANPERMEABILITAT
VON
ECOH
ZELLEN
IV
5
HALBWERTSZEITBESTIMMUNG
VON
3D*
IN
BI21(DE3)PLYSS-ZELLEN
55
IV
6
AUTOPROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
VON
3CD
IN
VIVO
UND
FREISETZUNG
VON
3D
56
IV
6
1
KINETIK
DER
EXPRESSION
VON
PET-3CD
IM
VERGLEICH
MIT
57
PET-3D*-IMMUNOBLOT
ANALYSE
IV
6
2
RADIOAKTIVE
EXPRESSIONSKINETIK
VON
3CD
IN
E.
COLI
STAMM
58
BL21(DE3)PLYSS
IV
6
3
HALBWERTSZEITBESTIMMUNG
DES
VORLAUFERPROTEINS
3CD
IN
E.
COLI
61
V.
DISKUSSION
63
V
1
REKOMBINANTE
EXPRESSION
IM
BAKTERIELLEN
SYSTEM
63
V
2
REKOMBINANTE
EXPRESSION
DER
HAV-POLYMERASE
UND
DES
VORLAUFERMOLE
65
KULS
3CD
IN
B.
COLI
V
2
1
EINFLUSS
DER
SHINE-DALGARNO-SEQUENZ
AUF
DIE
INITIATION
DER
65
TRANSLATION
V2
2
LOESLICHKEIT
DER
HAV-PROTEINE
3D
BZW
3D*
66
V
2
3
OPTIMIERUNG
DER
EXPRESSION
67
V
2
4
RADIOAKTIVE
EXPRESSIONSKINETIK
IN
B.
COLI
68
V
2
4
1
TOXIZITAET
VON
HAV-FUNKTIONSPROTEINEN
AUF
BL
COLI
68
V2
4
2
INTERNE
INITIATIONEN
DER
TRANSLATION
IM
GENOMABSCHNITT
3D
71
V2
5
AUTOPROTEOLYTISCHES
PROCESSING
VON
3CD
IN
VIVO
UND
71
FREISETZUNG
VON
3D
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
74
VII.
LITERATUR
76
LEBENSLAUF
82
DANKSAGUNG
83 |
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