Identifikation, molekulare und funktionelle Charakterisierung des cpc-3-Gens: ein Beitrag zur Aufklärung der Allgemeinen Kontrolle der Aminosäurebiosynthesen von Neurospora crassa
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1996
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| adam_text | IDENTIFIKATION, MOLEKULARE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DES CPC-3
GENS - EIN BEITRAG ZUR AUFKLAERUNG DER ALLGEMEINEN KONTROLLE DER
AMINOSAEUREBIOSYNTHESEN VON NEUROSPORA CRASSA VOM FACHBEREICH BIOLOGIE
DER UNIVERSITAET HANNOVER ZUR ERLANGUNG DES GRADES DOKTOR DER
NATURWISSENSCHAFTEN DR. RER. NAT. GENEHMIGTE DISSERTATION VON
DIPL.-BIOL. EVELYN SATTLEGGER GEBOREN AM 19. APRIL 1967 IN DALLAS (USA)
1996 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS SEITE KURZFASSUNG *
INHALTSVERZEICHNIS II ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IV I. EINLEITUNG 1. DIE
KONTROLLE DER AMINOSAEUREBIOSYNTHESEN IN NIEDEREN EUKARYOTEN . ...... 1
2. DER MECHANISMUS DER ALLGEMEINEN KONTROLLE DER AMINOSAEUREBIOSYNTHESEN
_. _ 2 2.1 KONTROLLELEMENTE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE . -4 2.2
KONTROLLELEMENTE IN NEUROSPORA CRASSA 5 3. REGULATION DER
TRANSLATIONSINITIATION DURCH EIF-2A KINASEN, AM BEISPIEL DES GCN2 DER
HEFE ..... .._ * -6 4. AMINOACYL-TRNA SYNTHETASEN UND DIE ERKENNUNG VON
AMINOSAEUREMANGEL ... 9 5. AUFGABENSTELLUNG: GIBT ES EIN DEM GCN2 DE R
HEFE HOMOLOGES GEN IN N. CRASSAL 10 II. MATERIAL UND METHODEN 1.
VERWENDETE ORGANISMEN UND NUKLEINSAEUREN 12 1.1 NEUROSPORA CRASSA STAEMME
_ ... ... .... . . . 12 1.2 ESCHERICHIA COLI STAEMME . ... . ... . . 13
1.3 VEKTOREN UND PLASMIDE . . . . . . ._.. ...13 1.4 DNA-BANKEN ...... .
. . . . - 15 2. NEUROSPORA CRASSA, KULTURBEDINGUNGEN UND METHODEN 16 2.1
DER ORGANISMUS NEUROSPORA CRASSA _._. . . . . 16 2.2 KULTURBEDINGUNGEN
UND STAMMHALTUNG _~ ........ 17 2.3 WACHSTUMSUNTERSUCHUNGEN . . . . _.
18 2.4 KREUZUNGEN 19 2.5 KOMPLEMENTATIONSTEST .. . ._ . _20 2.6
BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN .. . - . . .. . ...20 2.7
TRANSFORMATION VON N. CRASSA . _ 22 3. ESCHERICHIA COLI,
KULTURBEDINGUNGEN UND METHODEN 25 3.1 KULTUR UND STAMMHALTUNG _.. . . .
... .25 3.2 TRANSFORMATION VON E. COLI . . . . . . . . . 2 5 4.
DNA-TECHNIKEN 27 4.1 PLASMID- UND COSMID-DNA ISOLATION AUS E. COLI _. .
. ... _ 27 4.2 ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS N. CRASSA . . . . . . 28
4.3 ISOLATION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE-GELEN .29 4.4 LIGATION VON
DNA-FRAGMENTEN . 2 9 4.5 POLYMERASE KETTENREAKTION UND VERWENDETE PRIMER
30 4.6 SOUTHERN-BLOT UND DOT-BLOT EXPERIMENTE . 34 4.7 MARKIERUNG VON
DNA ... ._......_... . ... 35 4.8 SCREENING VON DNA-BIBLIOTHEKEN . 36
4.9 DNA-SEQUENZIERUNG UND SEQUENZERMITTLUNG VON DNA UND PROTEINEN _ .37
5. RNA-TECHNIKEN 39 5.1 ISOLATION VON RNA AUS N. CRASSA . 39 5.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON RNA . 40 5.3 NORTHERN-BLOT EXPERIMENTE 40
INHALTSVERZEICHNIS III. ERGEBNISSE 1. IDENTIFIKATION UND MOLEKULARE
CHARAKTERISIERUNG DES CPC-3 GENS VON N. CRASSA 42 1.1 N. CRASSA BESITZT
EINE EXPRIMIERTE EIF-2A KINASE-CHARAKTERISTISCHE SEQUENZ 42 1.1.1
NACHWEIS EINER EIF-2A KINASE-TYPISCHEN SEQUENZ MIT HILFE DER PCR 42
1.1.2 NACHWEIS DER IDENTIFIZIERTEN SEQUENZ IN EINEM TRANSKRIPT .... 47
1.1.3 NACHWEIS EINES SINGLE-COPY GENS MIT DER IDENTIFIZIERTEN SEQUENZ 49
1.1.4 GENOMISCHE KARTIERUNG DER IDENTIFIZIERTEN SEQUENZ ... . 50 1.2
ERMITTLUNG DES VOLLSTAENDIGEN OFFENEN LESERAHMENS DES CPC-3 GENS 51 1.2.1
SUBKLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT CPC-3 SEQUENZEN 51 1.2.2
DNA-SEQUENZANALYSE DES CPC-3 GENS ._..... 55 1.3 DAS POSTULIERTE CPC-3
GENPRODUKT IST DEM GCN2 STRUKTURELL HOMOLOG 64 1.3.1 DIE
EIF-2AKINASEDOMAENE . . . 65 1.3.2 DIE HISTIDYL-TRNA SYNTHETASE
(HISRS)-AEHNLICHE DOMAENE 68 1.3.3 DIE C-TERMINALE REGION . 70 1.3.4 DIE
N-TERMINALE REGION . .. . . 71 2. UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION DES CPC-3
GENS IN N. CRASSA 72 2.1 HERSTELLUNG EINER CPC-3: :HPH
DISRUPTIONSMUTANTE 72 2.1.1 STRATEGIE ZUR DISRUPTION DES GENS UND DER
SELEKTIVEN IDENTIFIKATION VON DISRUPTIONSMUTANTEN , - - - 73 2.1.2
HERSTELLUNG EINES DISRUPTIERTEN CPC-3 ALLELS . . ... .74 2.1.3
IDENTIFIKATION VON N. CRASSA TRANSFORMANDEN MIT DISRUPTIERTEM CPC-3
ALLEL 76 2.1.4 HERSTELLUNG UND UEBERPRUEFUNG HOMOKARYOTISCHER CPC-3::HPH
DISRUPTIONSSTAEMME.. . 78 2.2 STUDIUM DER CPC-3::HPH DISRUPTIONSMUTANTE
81 2.2. 1 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG UNTER REGULAEREN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN . _ . . . _ 81 2.2.2 STUDIEN ZUR ALLGEMEINEN
KONTROLLE DER AMINOSAEUREBIOSYNTHESEN . . .. 83 2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUM
WIRKORT DES CPC3 IN DER ALLGEMEINEN KONTROLLE DER AMINOSAEUREBIOSYNTHESEN
86 2.3.1 KOMPLEMENTATIONSSLUDIEN ... 86 2.3.2 HERSTELLUNG UND
UNTERSUCHUNG VON CPC-3,CPC-L UND CPC-3,CPC-2 DOPPELMUTANTEN . . 87 2.3.3
TRANSKRIPTSTUDIEN . 88 2.3.4 BEEINFLUSST CPC-3 DIE TRANSLATION DES CPC-LL
. 89 IV. DISKUSSION 94 ZUSAMMENFASSUNG 103 SUMMARY 105
LITERATURVERZEICHNIS 107
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