Molekulare Studien der a-1,4 Glucan Phosphorylasen in Vicia faba L. und transgenen Vicia narbonensis L.:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
11
STRUKTUR
UND
ZUSAMMENSETZUNG
VON
STAERKE
.
2
1.2.
STAERKESTOFIWECHSEL
UND
KOHLENHYDRATVERTEILUNG
IN
BLATTERN
.
3
1.2.1.
STAERKESYNTHESE
IN
BLAETTERN.
.
4
1.2.2.
REGULATION
DER
STAERKESYNTHESE
IN
BLAETTERN
.
4
1.2.3.
STAERKEABBAU
IN
BLAETTERN
.
5
1.2.4.
REGULATION
DES
STAERKEABBAUS
IN
BLAETTERN
.
5
13.
A-GLUCAN
PHOSPHORYLASEN
.
.
.
.
7
1.4.
STAERKESTOFIWECHSEL
IN
SPEICHERORGANEN
.
9
1.4.1.
STAERKESYNTHESE
IN
SPEICHERORGANEN
.
9
1
4.2.
STAERKEABBAU
IN
SPEICHERORGANEN
.
11
1.4.2.1.
STAERKEABBAU
IN
PERENNIERENDEN
SPEICHERORGANEN
.
11
1.4.2.2.
STAERKEABBAU
IN
GETREIDESAMEN
.
12
1.423.
STAERKEABBAU
IN
SAMEN
VON LEGUMINOSEN
.
13
1.5
DER
TRANSGENE
ANSATZ:
EINE
METHODE
ZUR
ANALYSE
VON
ENZYMFUENKTIONEN
IM
STOFIWECHSEL
.
14
1.6.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
15
2.
MATERIAL
.
16
2
1
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
GERAETE
.
16
2.2.
OLIGONUKLEOTIDE
.
16
2.3.
BAKTERIENSTAEMME
.
.
17
2.4
PLASMIDE
.
.
18
2.5
PFLANZEN-UND
SAMENMATERIAL
.
18
2.6
MEDIEN.
.
18
3.
METHODEN
.
18
3
1.
KLONIERUNGEN
.
18
3.2.
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
SPEZIFISCHER
CDNAS
.
18
3.2.1.
CDNA-BANK
DURCHMUSTERUNG
.
.
18
3.2.2.
DELETIONSREIHEN
UND
SEQUENZIERUNG
.
19
3.2.3.
VERVOLLSTAENDIGUNG
VON
CDNA-SEQUENZEN
MITTELS
YY5
-RACE
"
UND
RT-PCR
.
19
3
3.
DNA-ANALYSE
.
20
3.3.1.
ISOLIERUNG
VON
PFLANZEN-DNA
.
20
3.3.2.
PCR-AMPLIFIZIERUNG
.
20
3.3.3.
YYSOUTHERN
BLOT
"
-ANALYSE.
.
20
3.4.
RNA-ANALYSE
.
21
3.4.1.
ISOLIERUNG
VON
PFLANZEN-RNA
.
.
21
3.4.2.
,
NORTHERN
BLOT
"
-ANALYSE._
.
21
3.4.3.
RT-PCR
.
21
3.4.4.
IN
SIRU-HYBRIDISIERUNG
.
22
3.5.
TRANSFORMATION
VON
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
STAMM
EHA
101
.
22
3.6.
PFLANZENTRANSFONNATION
.
23
3.6.1.
TRANSFORMATION
VON
VICIA
NARBONENSIS
.
23
3.6.2.
TRANSFORMATION
VON
TABAK.
.
24
3.7.
KULTUR
DER
PFLANZEN.
.
24
3.8.
FUETTERUNGSEXPERIMENTE
MIT
IN
VITRO
KULTIVIERTEN
KOTYLEDONEN
.
25
3
9.
CHLOROPLASTENISOLIERUNG
.
.
25
3
10.
ANALYSE
VON
PROTEINEN.
.
25
3.10.1.
ANALYSE
DER
GLUCAN
PHOSPHORYLASE-AKTIVITAET
MITTELS
GEL-TESTVERFAHREN.
.
26
3.10.2.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.
.
26
3.10.3.
YYWESTERN
BLOT"
-ANALYSE
.
.
.
26
3.10.4.
IMMUNOZYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
DES
KARTOFIEL-TRANSGEN-PHOL
POLYPEPTIDES
IN
ISOLIERTEN
CHLOROPLASTEN
VON
TRANSGENEN
VIDA
NARBONENSIS
.
26
3.10.5.
BESTIMMUNG
DER
GESAMT-GLUCAN
PHOSPHORYIASE
AKTIVITAET
.
27
3.10.6.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAET
STAERKEHYDROLYSIERENDER
ENZYME.
.
27
3
10.6.1.
GESAMTHYDROLYTISCHE
AKTIVITAET
.
27
3
10.6.2.
ENDOAMYLOLYTISCBE
AKTIVITAET
-
.
27
3.10.6
3.
R-ENZYMAKTIVITAET
.
-
.
27
3.10
7.
BESTIMMUNG
DER
FRUKTOSE-1,6-BISPHOSPHATASE-AKTIVITAET
(FBPASE)
.
27
3
10
8.
BESTIMMUNG
DER
GLYZERINALDEHYDPHOSPHAT-DEHYDROGENASE-AKTIVITAET
(GAPDH)
.
28
3
10.9.
BESTIMMUNG
DER
UDP-GLUKOSE
PYROPHOSPHATASE-AKTIVITAET
(UGPASE)
.
28
3
11.
BESTIMMUNG
VON
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE.
.
28
4.
ERGEBNISSE
.
29
4.1.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
FUER
EINE
PLASTIDAERE
A-GLUCAN
PHOSPHORYIASE
(PHOL)
UND
EINER
FUER
EINE
ZYTOSOLISCHE
A-GLUCAN
PHOSPHORYIASE
(PHO2)
KODIERENDEN
CDNA
AUS
KOTYLEDONEN
VON
VICIAFABA
L.
29
4.11.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINER
FUER
EINE
ZYTOSOLISCHE
A-GLUCAN
PHOSPHORYIASE
KODIERENDEN
CDNA
.
29
4.1.2.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINER
FUER
EINE
PLASTIDAERE
A-GLUCAN
PHOSPHORYIASE
KODIERENDEN
CDNA
.
31
4
13.
VERGLEICH
DER
PNMAERSTRUKTUR
DER
ZYTOSOLISCHEN
PHO2
UND
PLASTIDAEREN
PHOL
AUS
VICIAFABA
MIT
GLUCAN
PHOSPHORYLASEN
AUS
ANDEREN
PFLANZEN
.
34
4.2.
VERGLEICH
DER
GENOMISCHEN
EXON/INTRON-STRUKTUR
IM
BEREICH
DER
YYINSERTION
"
ZWISCHEN
DEN
PHOL
-
UND
PHO2-GENEN
VON
VICIA
FABA
L
.
36
4.3.
GENOMISCHE
YYSOUTHERN
BLOT
"
-ANALYSE
DER
PHO-ISOFORMEN
.
37
4.3.1.
PHOL-ISOFORM.
.
37
4.3.2.
PHO2-ISOFOMT
.
38
4.4.
EXPRESSIONSANALYSE
DER
PHOL
UND
PHO2-GENE
VON
VICIAFABA
L
.
39
4.4.1.
GEWEBESPEZIFISCHE
AKKUMULATION
DER
PHOL
UND
PHO2-SPEZIFISCHEN
MRNAS
IM
VERGLEICH
ZUR
ENZYMAKTIVITAET
.
39
4
4.2.
TAGESRHYTHMUS
VON
BLATT-MRNA
UND
ENZYMAKTIVITAET
DER
PHO-ISOFORMEN
.
43
4.4.3.
MRNA-AKKUMULATION
UND
ENZYMAKTIVITAET
VON
PHO-ISOFORMEN
IN
DER
SAMENSCHALE
UN
VERGLEICH
ZUR
STAERKEAKKUMULATION
.
44
4.4.4.
UNTERSUCHUNGEN
DER
EXPRESSION
DER
PHO-ISOFORMEN
WAEHREND
DER
KOTYLEDONENENTWICKLUNG
UND
KEIMUNG
.
46
4.4.4
1.
YYNORTHERN
BLOT
"
-ANALYSE
DER
EXPRESSION
DER
PHO-ISOFORMEN
.
46
4
4
4.2.
IN
SIRU-HYBRIDISIERUNG
DER
PHO-ISOFORMEN
IN
SICH
ENTWICKELNDEN
KOTYLEDONEN
.
48
4
4.4.3.
UNTERSUCHUNG
ZUM
EINFLUI!
VON
HEXOSEN
UND
STICKSTOFILIMITIERUNG
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
PHO-ISOFORMEN
IM
VERGLEICH
ZUM
LEGUMIN
B
.
50
4.4
4
4
ENZYMAKTIVITAET
DER
PHO-ISOFORMEN
IN
KOTYLEDONEN
WAEHREND
DER
SAMENENTWICKLUNG
UND
KEIMUNG
IM
GELTEST
.
52
4
4.4
5
VERGLEICHENDE
ANALYSE
DER
AKTIVITAET
VON
GLUCAN
PHOSPHORYLASEN
MIT
STAERKEHYDROLY
SIERENDEN
ENZYMEN
IN
KOTYLEDONEN
WAEHREND
DER
KEIMUNG
UND
FRUEHEN
SAEMLINGSENTWICKLUNG
.
54
4.5.
TRANSFORMATION
UND
EXPRESSION
EINER
KARTOFFEL-PHOL
IN
VICIA
NARBONENSIS
.
57
4
5
1.
BESCHREIBUNG
DER
CHIMAEREN
GENKONSTRUKTE
.
57
4.5.2.
TRANSFONNATIONSRATE
DER
TRANSGENEN
LINIEN
.
_
.
59
4.5.3
WACHSTUMSVERHALTEN
DER
TRANSGENEN
F0
UND
FL-GENERATIONEN
.
60
4
5.4.
ANALYSE
DER
TRANSGEN-PHOL-EXPRESSION
UNTER
KONTROLLE
DES
35S-PROMOTORS
IN
DEN
BLAETTERN
TRANSGENER
F0
UND
FL-PFLANZEN
.
.
62
4.5.4.1
MRNA
UND
ENZYMAKTIVITAEL
.
_.
.
62
4.5.4.2.
LOKALISIERUNG
DER
TRANSGENEN
PHOL
IN
CHLOROPLASTEN
.
63
4.5.5.
UNTERSUCHUNG
DES
GEHALTES
AN
STAERKE
UND
LOESLICHEN
ZUCKERN
IN
DEN
BLAETTERN
VON
35S-STP1
F0
UND
FL-PFLANZEN
.
66
4
5
6
VERGLEICHENDE
DARSTELLUNG
DER
PHO
UND
DER
AMYLOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
KARTOFFELBLATT,
VICIA
FABA
UND
VICIA
NARBONENSIS-BLXTT.
.
67
4.5.7
ANALYSE
DER
TRANSGEN-PHOL-EXPRESSION
UNTER
KONTROLLE
VON
LEGB4
UND
USP-PROMOTOR
IN
KOTYLEDONEN
.
68
4.5.7.1
MRNA-UND
ENZYMAKTIVITAET
.
68
4
5
7.2.
ANALYSE
DES
ELEKTROPHORETISCHEN
LAUFVERHALTENS
DER
TRANSGEN-PHOL
.
70
4
5.7.3
DETAILLIERTE
ANALYSE
DER
TRANSGEN-PHOL-EXPRESSION
WAEHREND
DER
SAMENENTWICKLUNG
UND
KEIMUNG
.
72
4
6.
ANALYSE
DER
PHO-AKTIVITAET
IN
REIFEN,
GELAGERTEN
SAMEN
VERSCHIEDENER
PFLANZENARTEN.
.
75
5.
DISKUSSION
.
76
5
1
STRUKTUR
UND
EVOLUTION
DER
PFLANZLICHEN
PHO-ISOFORMEN
.
76
5.1.1.
DIE
POSITION
DER
PHOL-INSERTION.
.
76
5
1.2.
EVOLUTIONAERE
BETRACHTUNG
DER
PFLANZLICHEN
GLUCAN
PHOSPHORYLASEN.
.
78
5.2
DAS
EXPRESSIONSVERHALTEN
DER
PHO-ISOFORMEN
IN
PFC/A
.
80
5.2
1.
ENTWICKLUNGSSPEZIFISCHE
EXPRESSION
DES
PHOL-GENS
IN
VICIA
.
81
5.2.2
EINFLUSS
METABOLISCHER
FAKTOREN
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
PHO-ISOFORMEN
WAEHREND
DER
KOTYLEDONENENTWICKLUNG
.
81
5.2.3.
HINWEISE
AUF
POSTTIANSKRIPTIONELLE
REGULATION
DER
PHO-ISOFORM
EXPRESSION
BEI
VICIA
.
82
5.3
FUNKTIONELLE
DEUTUNG
DER
EXPRESSIONS
UND
ENZYMAKTIVITAETSMUSTER
DER
PHO
ISOFORMEN
IN
VICIA
FABA
UND
TRANSGENEN
VICIA
NARBONENSIS-PUEANZEN
.
83
5.3.1.
PHO2
UND
IHR
UNBEKANNTES
SUBSTRAT:
EINE
SPEKULATIVE
BETRACHTUNG
.
83
5.3.2.
DIE
PHOL
UND
DER
STAERKEHAUSHALT
IM
BLATT:
EINE
ARTVERGLEICHENDE
BETRACHTUNG
.
.
85
5.3.3.
PHOL
UND
STAERKESYNTHESE
IN
SPEICHERORGANEN:
EIN
WIDERSPRUCH?
.
87
5.4.
PHO-ISOFORM-SPEICHERUNG
IN
KOTYLEDONEN:
EINE
NEUE
THESE
ZUR
REGULATION
DER
STAERKE-MOBILISIERUNG
WAEHREND
DER
KEIMUNG
UND
SAEMLINGSENTWICKLUNG
.
89
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
94
7.
ANHANG
.
.
96
7.1.
AMINOSAEURENVERGLEICH
ALLER
BEKANNTEN
A-GLUCAN
PHOSPHORYLASE
SEQUENZEN.
.
96
.
LITERATURVERZEICHNIS
.
99 |
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