Wirkung von Estrogenen, Antiestrogenen und Wachstumsfaktoren auf Funktionen des Estrogenrezeptors: Untersuchungen mit transient und stabil transfizierten Reporterplasmiden
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adam_text | 5 WIRKUNG VON ESTROGENEN, ANTIESTROGENEN UND WACHSTUMSFAKTOREN AUF
FUNKTIONEN DES ESTROGENREZEPTORS UNTERSUCHUNGEN MIT TRANSIENT UND STABIL
TRANSFIZIERTEN REPORTERPLASMIDEN DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER
NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET IV - CHEMIE UND PHARMAZIE - DER
UNIVERSITAET REGENSBURG VORGELEGT VON FRANK HAFNER AUS REGENSBURG 1996
INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 1 1.1. DIE TRANSKRIPTION 3 1.1.1. DIE
BASALE TRANSKRIPTION 3 1.1.1.1. DIE TATA-BOX ALS MINIMALPROMOTOR 3
1.1.1.2. ASSEMBLIERUNG DER BASALEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 4 1.1.2. DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG 5 1.1.2.1. UPSTREAM-PROMOTOR-ELEMENTS 5
1.1.2.2. ENHANCER 6 1.1.2.3. AUFBAU UND WIRKUNGSWEISE VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 7 1.1.3. CHROMATIN UND TRANSKRIPTION . 9 1.1.3.1.
AUFBAU DES CHROMATINS , 9 1.1.3.2. EINFLUSS DER CHROMATINSTNIKTUR AUF DIE
TRANSKRIPTION 9 1.2. DIE KERNREZEPTOR-FAMILIE 12 1.2.1. DER
ESTROGENREZEPTOR 14 1.2.1.1. DIE DNA-BINDUNGSDOMAENE C 15 1.2.1.2. DIE
HORMONBINDUNGSDOMAENE E 17 1.2.1.3. HITZESCHOCKPROTEINE 18 1.2.1.4.
REZEPTORDIMERISIERUNG 19 1.2.1.5. TRANSAKTIVIERUNGSFUNKTIONEN 19
1.2.1.6. PHOSPHORYLIERUNG DES ER 22 1.2.1.7. LIGANDUNABHAENGIGE
AKTIVIERUNG DES ER 23 1.3. PROBLEMSTELLUNG 28 2. MATERIALIEN UND
METHODEN 31 2.1. VERWENDETE MATERIALIEN 31 2.1.1. CHEMIKALIEN,
BIOCHEMIKALIEN, KITS 31 2.1.2. ANTIESTROGENE 33 2.1.3. WACHSTUMSFAKTOREN
35 2.1.4. PLASMIDE 35 2.1.4.1. EXPRESSIONSVEKTOREN 35 2.1.4.2.
RESISTENZPLASMIDE 36 2.1.4.3. REPORTERPLASMIDE 37 2.1.5. BAKTERIEN UND
EUKARYONTISCHE ZELLINIEN 39 2.1.6. BAKTERIENMEDIEN 40 2.1.7. PUFFER UND
LOESUNGEN 40 2.2. ANGEWANDTE METHODEN 43 2.2.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN 43 2.2.1.1. ANZUCHT UND KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 43 2.2.1.2.
TRANSFORMATION VON E. COLI DH5A 43 2.2.1.3. PLASMID-DNA MINI-, MIDI- UND
MAXIPRAEPARATION 44 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. .4. DNA-KONZENTRATIONS-
UND REINHEITSBESTIMMUNG 45 .5. RESTRIKTIONSVERDAU . 45 .6.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE , 46 .7. DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 46
.8. PHENOLREINIGUNG UND FAELLUNG VON DNA 47 1.9. LIGATION 47 2.2.1.10.
AUFFUELLEN VON UEBERHAENGENDEN DNA-ENDEN 47 2.2.1.11. PRIMERSYNTHESE 48
2.2.2. GENOMISCHER FOOTPRINT 48 2.2.2.1. BEHANDLUNG VON ZELLEN MIT DMS
UND ISOLIERUNG 48 VON GENOMISCHER DNA 2.2.2.2. IN VITRO-METHYLIERUNG DES
REPORTERPLASMIDS 51 2.2.2.3. RADIOAKTIVE MARKIERUNG EINES PRIMERS 51
2.2.2.4. REINIGUNG DES RADIOAKTIV MARKIERTEN PRIMERS 52 2.2.2.5.
RADIOAKTIVE MARKIERUNG EINES DNA-LAENGENSTANDARDS 53 2.2.2.6. ANSATZ
EINER PRIMER-EXTENSION-REAKTION 53 2.2.2.7.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND AUTORADIOGRAPHIE 54 2.2.3.
ZELLKULTUR UND TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE 54 2.2.3.1. ALLGEMEIN 54
2.2.3.2. STABILE TRANSFEKTION UND SELEKTION 57 2.2.3.3. LUZIFERASE-ASSAY
AUF 6-LOCH-PLATTEN 59 2.2.3.4. LUZIFERASE-ASSAY AUF MT-PLATTEN 64
2.2.3.5. SS-GALACTOSIDASE-ASSAY AUF 6-LOCH-PLATTEN 66 3. ERGEBNISSE 67
3.1. GENOMISCHER IN VIVO-FOOTPRINT 67 3.1.1. THEORETISCHER HINTERGRUND
67 3.1.2. VORHANDENE VORARBEITEN 69 3.1.2. 1. AUSWAHL DER ZELLINIE FUER
DEN GENOMISCHEN IN VIVO-FOOTPRINT 69 3.1.2.2. ERSTELLUNG EINER
OPTIMIERTEN VORSCHRIFT ZUR RADIOAKTIV- 69 MARKIERUNG UND REINIGUNG EINES
PRIMERS 3.1.3. WEITERE OPTIMIERUNG DES GENOMISCHEN FOOTPRINT 70 3.1.3.1.
AUSTESTEN VERSCHIEDENER DMS-KONZENTRATIONEN 70 3.1.3.2. AUSTESTEN
VERSCHIEDENER DMS-INKUBATIONSZEITEN 71 3.1.3.3. EINSATZ VON PLASMID ALS
DNA-TEMPLATE 73 3.1.3.4. VARIATION DER DMS-BEHANDLUNG UND DER
DNA-AUFREINIGUNG 74 3.1.4. DISKUSSION 77 3.2. TRANSIENTE TRANSFEKTION 81
3.2.1. EINFLUSS VON WACHSTUMSFAKTOREN AUF DIE ER-ABHAENGIGE 81
GENEXPRESSION 3.2.1.1. HUMANE CERVIXCARCINOM-ZELLINIE HELA 81 EPIDERMAL
GROWTH FACTOR 82 INSULIN 84 INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-I 91 3.2.1.2.
HUMANE MAMMACARCINOM-ZELLINIE MCF-7 92 EPIDERMAL GROWTH FACTOR 92
INSULIN 93 INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-I ~ 94 3.2.1.3.
KONTROLLTRANSFEKTIONEN MIT HOMOLOGEN UND HETEROLOGEN 100 SYSTEMEN 3.2.2.
DISKUSSION 106 3.3. STABILE TRANSFEKTION 113 3.3.1. KLONIEREN VON
ZEUINIEN MIT STABIL INTEGRIERTEM 113 REPORTERPLASMID 3.3.1.1. HUMANE
CERCIXCARCINOM-ZELLINIE HELA 113 3.3.1.2. HUMANE MAMMACARCINOM-ZELLINIE
MCF-7 116 III 3.3.2. CHARAKTERISIERUNG UND AUSWAHL STABILER 117
MCF-7-TRANSFEKTANTEN 3.3.2.1. REGULIERBARKEIT UND KINETIK DER
LUZIFERASEEXPRESSION 117 3.3.2.2. STABILITAET DER TRANSFEKTION VON
MCF-7/2A-ZELLEN 120 3.3.2.3. VALIDIERUNG VON MCF-7/2A-TRANSFEKTANTEN 121
ANHAND DER TRANSIERTEN TRANSFEKTION 3.3.3. MINIATURISIERUNG DES
LUZIFERASE-ASSAYS AUF 124 MIKROTITERPLATTEN 3.3.3.1. TEST DES
LUC-LITE*-LUZIFERASE-ASSAY-SYSTEMS 124 3.3.3.2. OPTIMIERUNG DES
LUZIFERASE-ASSAY-SYSTEMS VON PROMEGA 125 3.3.3.3. VERGLEICH DES
LUZIFERASE-ASSAYS: 128 6-LOCH-PLATTEN/MIKROTITERPLATTEN 3.3.3.4.
STRUKTUR-WIRKUNGSUNTERSUCHUNGEN IM MT-LUZIFERASE-ASSAY 129 3.3.4.
EFFEKTE DER MCF-7/2A-LANGZEITBEHANDLUNG MIT 130 ANTIESTROGENEN AUF DIE
LUZIFERASEAKTIVITAET 3.3.4.1. 4 OH-TAMOXIFEN-BEHANDLUNG 130 3.3.4.2. ICI
182,780-BEHANDLUNG 132 3.3.5. EINFLUSS VON WACHSTUMSFAKTOREN AUF DIE
ER-AEBHAENGIGE 133 GENEXPRESSION BEI DEN STABILEN TRANSFEKTANTEN 3.3.5.1.
MCF-7/2A-ZELLEN 133 3.3.5.2. MCF-7/7D-ZELLEN 139 3.3.6. DISKUSSION 140
3.4. TRANSFEKTION EINES ER-CHIMAEREN: GAL4-HEG0 146 3.4.1. STRATEGIE BEI
DER KLONIERUNG VON GAL4-HEG0 147 3.4.2. TESTUNG UND OPTIMIERUNG DES
SYSTEMS 148 3.4.2.1. TEST DES ER-CHIMAEREN AUF FUNKTIONALITAET NACH
ERE-BINDUNG 148 3.4.2.2. TEST DES REPORTERPLASMIDS AUF BASALAKTIVIERUNG
148 3.4.2.3. KOTRANSFEKTION DES ER-CHIMAEREN MIT DEM 149 REPORTERPLASMID
C3G5 LUC 3.4.2.4. EINFLUSS VON ANTIESTROGENEN UND INSULIN 152 AUF DIE
LUZIFERASEAKTIVITAET 3.4.3. DISKUSSION 153 4. ZUSAMMENFASSUNG 156 5.
LITERATURVERZEICHNIS 159 IV
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