Analyse einer Klasse von evolutionär konservierten Genen im Nematoden Onchocerca volvulus Leuckart:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
1996
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | [5], 116 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
ONCHOZERKIASIS
1
1.2
DAS
KRANKHEITSBILD
DER
ONCHOZERKIASIS
1
1.3
NEMATODA
3
1.4
DER
ERREGER
DER
ONCHOZERKIASIS:
ONCHOCERCA
VOLVULUS
4
1.4.1
DIE
SYSTEMATISCHE
EINORDUNG
VON
ONCHOCERCA
VOLVULUS
4
1.4.2
DER
LEBENSZYKLUS
VON
ONCHOCERCA
VOLVULUS
4
1.4.3
DIE
AUSEINANDERSETZUNG
DER
SIMULIE
MIT
O
VOLVULUS
5
1.44
DIE
EINFLUESSE
VON
O.
VOLVULUS
UND
ANDEREN
PARASITISCHEN
NEMATAODEN
AUF
IHRE
WIRTE
6
1.5
BEKAEMPFUNGSMASSNAHMEN
GEGEN
O.
VOLVULUS
7
1.6
DIE
ENTWICKLUNG
VON
O.
VOLVULUS
ERFORDERT
DIE
STADIENSPEZIFISCHE
EXPRESSION
VON
GENEN
8
1.7
DIE
INITIATION
DER
TRANSKRIPTION
PROTEINCODIERENDER
GENE
IN
EUKARYONTEN
8
1.7.1
REGULATIVE
ELEMENTE
9
1.8
FUNKTIONEILE
DOMAENEN
IN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
9
1.8.1
NUKLEINSAEUREBINDENDE
DOMAENEN
10
1.
8.1.1
DER
'KLASSISCHE'
ZINK
FINGER
DES
CYSA-HISJ-TYPS
11
1.8.1.2
STRUKTURELLE
EIGENSCHAFTEN
DER
CYSZ-HISZ-ZINK
FINGER-DOMAENE
12
1.
8.1.3
DIE
INTERAKTION
EINES
CYSZ-HISZ-ZINK
FINGERS
MIT
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
13
1.
8.1.4
DER
'H-C-LINK'
-
EINE
KONSERVIERTE
VERBINDUNGSREGION
ZWISCHEN
ZWEI
ZINK
FINGER-DOMAENEN
14
1.8.1.5
DAS
ZINK
FINGER-MOTIV
IST
EVOLUTIONAER
KONSERVIERT
14
1.8.2
AKTIVIERENDE
DOMAENEN
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
15
1.9
TRANSKNPTNNELLE
REPRESSION
15
1.10
DIE
STABILITAET
EINER
MRNA
IST
DURCH
IHRE
PRIMAERSEQUENZ
FESTGELEGT
16
1.11
REGULATION
DER
TRANSLATIONSINITIATION
16
1.12
AKTIVIERUNG
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
DURCH
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATION
17
1.13
DIE
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
EINES
PROTEINS
WIRD
DURCH
SIGNALSEQUENZEN
VERMITTELT
17
1.13.1
DIE
POSTTRANSLATIONALE
LOKALISATION
IN
DEN
ZELLKERN
18
1.13.2
PROTEINE
DES
SEKRETORISCHEN
TRANSPORTWEGES
19
1.13.2.1
EIN
SIGNALPEPTID
VERMITTELT
DEN
EINTRITT
IN
DAS
ENDOPLASMATISCHE
RETIKULUM
19
1.13.2.2
N-GEKOPPELTE
GLYKOSYLIERUNG
FINDET
IN
DEN
KOMPARTIMENTEN
DES
SEKRETORISCHEN
T
RANSPORTWEGES
STATT
1.13.3
KOMPETITION
ZWISCHEN
LOKALISATIONSSIGNALEN
8
8
I
NHALTSVERZEICHNIS
1.14
ZIELSETZUNG
21
2
MATERIAL
UND
METHODEN
22
2.1
CHEMIKALIEN
UND
BIOREAGENZIEN
22
2.2
STERILISIERUNG
DER
LOESUNGEN
UND
GERAETE
22
2.3
ISOLIERUNG
VON
ADULTEN
O.
VOLVULUS
AUS
ONCHOZERKOMEN
22
2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
22
2.4.1
RADIOAKTIVES
MARKIEREN
VON
DNA
22
2.4.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
23
2.4.3
DURCHMUSTERN
EINER
GENOMISCHEN
XFIX
II
BIBLIOTHEK
VON
O.
VOLVULUS
23
2.4.4
DNA-PRAEPARATION
AUS
XFIX
II
PHAGEN
24
2.
4.5
SICHTEN
EINER
X
ZAP
II
BIBLIOTHEK
AUS
CDNA
ADULTER
O.
VOLVULUS
WEIBCHEN
24
2.4.6
HYDROLYSE
VON
DNA
MIT
HILFE
VON
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
25
2
4.7
DEPHOSPHORYIERUNG
DER
5'-ENDEN
VON
DNA
25
2.4.8
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
25
2.4.9
ELUTION
UND
AUFREINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
DEM
AGAROSEGEL
26
2.4.10
SOUTHERN
BLOT-ANALYSEN
26
2.4
10.1
HYBRIDISIERUNG
EINES
SOUTHEM-BLOTS,
WELCHER
GENOMISCHE
DNA
VON
C.
ELEGANS
UND
O.
VOLVULUS
ENTHIELT
26
2.4.11
GEWINNUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
ADULTEN
O.
VOLVULUS
WEIBCHEN
27
2.4.12
NORTHERN
BLOT-ANALYSEN
27
2.4.13
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
27
2.4.14
REVERSE
TRANSKRIPTION
28
2.4.15
POLYMERASE-KETTENRAKTION
28
2.4.15.1
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
CDNA
28
2.4.15.2
AMPLIFIKATION
VON
SPEZIFISCHEN
DNA-FRAGMENTEN
ZUM
ZWECK
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINEXPRESSION
29
2.4.16
LIGATION
UND
SUBKLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
2.4.16.1
SUBKLONIERUNG
IN
PBLUESCRIBE
29
2.4.16.2
SUBKLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
IN
DEN
PCRYYLL
PLASMIDVEKTOR
30
2.4.16.3
SUBKLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
IN
DIE
EXPRESSIONSVEKTOREN
PJC45FLAG,
UND
PBSV-8HIS
SOWIE
IN
DAS
EXPRESSIONSPLASMID
FHL-1
SCRS
2-6
30
2.4.17
HERSTELLEN
VON
KOMPETENTEN
ESCHERICHIA
COLI
DH5A
UND
PAPIACI
0
(DE3)
31
2.4.18
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
BAKTENEN
31
2.4.19
PLASMIDPRAEPARATION
IM
KLEINEN
MASSSTAB
32
2.4.20
PLASMIDPRAEPARAIION
NACH
MACHEREY-NAGEL
32
2.4
21
SEQUENZANALYSE
VON
PLASMID-DNA
32
I
NHALTSVERZEICHNIS
25
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
34
2.
5.1
DISK-ELEKTROPHORESE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
(SDS-PAGE)
34
2.
5.2
FAERBEN
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
34
2.
5.2.1
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
G
34
2.
5.2.2
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
34
2.
5.2.3
FAERBUNG
MIT
KALIUMCHLORID
35
2.
5.3
HERSTELLUNG
EINES
SYNTHETISCHEN
PEPTIDES
35
2.
5.4
ANTIKOERPER
35
2.
5.4.1
PRIMAERE
ANTIKOERPER
35
2.
5.4.2
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
UND
PROTEIN
G
35
2.5.5
WESTERN
BLOT
36
2
5.6
IMMUNODETEKTION
TRANSFERIERTER
PROTEINE
36
2.5.7
NACHWEIS
N-GLYKOSYIIERTER
PROTEINE
37
2.5.8
REKOMBINANTE
EXPRESSION
DES
OVZF2-FLAG-PROTEINS
IN
E
COH
37
2.
5.8.1
ANREICHERUNG
DES
REKOMBINANTEN
OVZF-2FLAG-PROTEINS
38
2.
5.8.2
ELUTION
DES
REKOMBINANTEN
OVZF-2FLAG-PROTEINS
AUS
DEM
POLYACRYLAMIDGEL
38
2.5.9
REKOMBINANTE
PROTEINEXPRESSION
MRT
HILFE
DES
EUKARYONTISCHEN
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEMS
39
2.
5.9.1
INSEKTEN-ZELLKULTUR
39
2.
5.9.2
TRANSFEKTION
DER
S/9-ZELLEN
MIT
REKOMBINANTER
BACULOGOLDYY
BACULOVIRUS
DNA
UND
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
39
2.
5.9.3
AUFREINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
40
2.5.10
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
41
2.5.11
N-TERMINALE
SEQUENZANALYSE
VON
PROTEINEN
41
2.
5.12
INHIBITION
DER
N-GEKOPPEITEN
GLYKOSYLIERUNG
REKOMBINANTER
OVZF-PROTEINE
DURCH
BEHANDLUNG
MIT
TUNICAMYCIN
42
2.
5.13
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
DES
REKOMBINANTEN
OVZF-2EXP-PROTEINS
IN
S/9-LNSEKTENZELLEN
MIT
HILFE
DER
IMMUNFLUORESZENZ
42
2
5.14
ERMITTELN
DER
HYDROPHOBIZITAET
EINER
POLYPEPTIDSEQUENZ
43
2.
5.15
UNTERSUCHUNG
DER
REAKTIVITAET
VON
SEREN
VON
ONCHOZERKIASISPATIENTEN
MIT
REKOMBINANTEM
OVZF-2FLAG-PROTEIN
43
2.5.16
LOKALISATION
VON
0.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-PROTEINEN
IM
INFEKTIOESEN
L3
STADIUM
VON
O.
VOLVULUS
43
I
NHALTSVERZEICHNIS
3
ERGEBNISSE
44
3.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
ZINK
FINGER-KLONE
AUS
ONCHOCERCA
VOLULUS
44
3.
2
CHARAKTERISIERUNG
DER
VIER
GENOMISCHEN
KLONE
OVZF-1.
OVZT-4,
OVZF-5
UND
OVZF-6
44
3.2.1
SOUTHERN
BLOT-ANALYSEN
44
2.2.2
SEQUENZANALYSEN
VON
OVZI-1,
OVZF-4,
OVZF-5
UND
OVZI-6
45
3.
2.3
SEQUENZHOMOLOGIEN
DER
O.
VOLVULUS
'ZINK
FINGER-GENE'
ZUM
C.
ELEGANS
TRA-J-GEN
47
3.3
'ZINK
FINGER-GENE'
IM
GENOM
VON
C.
ELEGANS
UND
O.
VOLVULUS
48
3.4
DIE
GENOMISCHE
ORGANISATION
DES
OVZF
J-GENS
50
3.4.1
DER
5'-UNTRANSLATIERTE
BEREICH
DES
OVZF-1-GENS
51
3.4.2
DER
3'-UNTRANSLATIERTE
BEREICH
51
3.4.3
DER
OFFENE
LESERAHMEN
DES
OVZT-J-GENS
53
3.5
DAS
OVZF-1-PROTEIN
53
3.5.1
HYDROPHOBIZITAETSANALYSE
DES
OVZF-1-PROTEINS
53
3.5.2
DIE
ZINK
FINGER-REGION
54
3.5.3
POTENTIELLE
KEMLOKALISATIONSSIGNALE
INNERHALB
DER
OVZF-1-SEQUENZ
55
3.5.4
CONSENSUS-SEQUENZEN
FUER
N-GEKOPPELTE
GLYKOSYLIERUNG
56
3.
5
5
DIE
OVZF-1
UND
OVZF-2-PROTEINE
BESITZEN
EINE
MOEGLICHE
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERENDE
DOMAENE
56
3.6
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DER
O.
VOLVULUS
'ZINK
FINGER-GENE'
AUF
MRNA-EBENE
57
3.6.1
DURCHMUSTERN
DERX.
ZAP
IL-BIBLIOTHEK
AUS
CDNA
ADULTER
O.
VOLVULUS
WEIBCHEN
57
3.6.2
NORTHERN
BLOT-ANALYSE
58
3.
6.3
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
SPEZIFISCHER
O.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-FRAGMENTE
MIT
DER
PCR
58
3.6.3.1
ADULTE
O.
VOLVULUS
WEIBCHEN
58
3.6.3.2
INFEKTIOESE
LARVEN
(L3)
58
3.
7
DIE
O.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-PROTEINE
OVZF-1
UND
OVZF-2
TEILEN
DIE
UNGEWOEHNLICHE
KOMBINATION
EINES
HYDROPHOBEN
N-TERMINUS
MIT
ZINK
FINGER-DOMAENEN
62
3.8
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DES
N-TERMINALEN
SIGNALPEPTIDS
VON
OVZF-2
63
3.8.1
ANALYSE
DES
OVZF-2-SIGNALPEPTIDS:
DER
DOMAENENAUSTAUSCH
64
3.9
REKOMBINANTE
EXPRESSION
VON
O.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-POTEINEN
IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
67
3.9.1
SYNTHESE
EINES
OVZF-2EXP-EXPRESSIONSPLASMIDES
67
3
9.2
EXPRESSIONSKINETIK
DES
REKOMBINANTEN
OVZF-2EXP-PROTEINS
68
3.9.3
DAS
REKOMBINANTE
OVZF-2EXP-PROTEIN
IST
N-GLYKOSYLIERT
68
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.9.4
DAS
REKOMBINANTE
OVZF-2EXP-PROTEIN
WIRD
MIT
NIEDRIGER
EFFIZIENZ
VON
SI9-ZELLEN
SEZERNIERT
70
3.
10
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
DES
REKOMBINANTEN
OVZF-2EXP-PROTEINS
MIT
HILFE
DER
IMMUNFLUORESZENZ
71
3.
11
VERGLEICH
DER
SIGNALPEPTIDE
SPOVZF
UND
SPH
73
3.
12
DAS
SEZEMIERTE
PROTEIN
SPOVZF/OVZF-LP/E
IST
N-GLYKOSYLIERT
74
3.13
REKOMBINANTE
EXPRESSION
DES
OVZF-2FLAG-PROTEINS
IN
E
COLI
76
3.14
REAKTIVITAET
VON
SEREN
VON
ONCHOZERKIASISPATIENTEN
MIT
DEM
REKOMBINANTEN
OVZF-2FLAG-PROTEIN
78
3.15
LOKALISATION
EINES
OVZF-PROTEINS
IN
0.
VOLVULUS
L3-STADIEN
80
4
DISKUSSION
YY1
4.1
DIE
O.
VOLVULUS
'ZINK
FINGER-GENE'
81
4.2
DIE
O.
VOLVULUS
'ZINK
FINGER-GENE'
SIND
MITGLIEDER
EINER
GENTAMUE
82
4.3
DIE
EXPRESSION
VON
OVZF-2
ERFOLGT
STADIEN
SPEZIFISCH
IN
L3
84
4.4
DIE
OVZF
1-PROMOTORREGION
85
4.5
HINWEISE
AUF
MRNA-DESTABILISIERENDE
ELEMENTE
IM
3'-UTR
DES
OVZM-GENS
85
4.6
DIE
0.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-PROTEINE
BESITZEN
CHARAKTERISTIKA
EUKARYONTISCHER
T
RANSKRIPTIONSFAKTOREN
87
4.7
NICHT
ALLE
ZINK
FINGER-PROTEINE
SIND
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
91
4.8
DIE
REKOMBINANTE
PROTEINEXPRESSION
IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
91
4.9
DAS
SIGNALPEPTID
DES
OVZF-2-PROTEINS
92
4.10
DIE
REKOMBINANTEN
O.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-PROTEINE
OVZF-2EXP
UND
OVZF-1P/E
SIND
N-GLYKOSYLIERT
93
4.11
OVZF-2
IST
EIN
IMMUNOGENES
PROTEIN
95
4.
12
DIE
LOKALISATION
EINES
NATIVEN
OVZF-PROTEINS
IM
INFEKTIOESEN
L3-STADIUM
96
4.
13
UEBERLEGUNGEN
ZUR
FUNKTION
DER
0.
VOLVULUS
ZINK
FINGER-PROTEINE
96
4.
14
AUSBLICK
99
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