Untersuchungen zur Funktion von Stärke-Synthasen in der Kartoffel (Solanum tuberosum L.):
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON
STAERKE-SYNTHASEN
IN DER KARTOFFEL (SOLANUM TUBEROSUM L.)
INAUGURAL-DISSERTATION
ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE
IM
FACHBEREICH BIOLOGIE
DER FREIEN UNIVEISITAET BERLIN
VORGELEGT VON
GEMOT J.W. ABEL
AUS HEIDELBERG
1995
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1.1. STAERKEBIOSYNTHESE IN HOEHEREN PFLANZEN 2
1.2. STAERKEABBAU 5
1.3. DAS STAERKEKORN 6
1.3.1. BIOGENESE UND STRUKTUR DES STAERKEKORNS 6
1.3.2. INITIATION DER STAERKESYNTHESE 7
1.3.3. STAERKEKORN-GEBUNDENE PROTEINE 8
1.4. STAERKE-SYNTHASEN 8
1.4.1. STAERKEKORN-GEBUNDENE SYNTHASEN 9
1.4.2. LOESLICHE STAERKE-SYNTHASEN 10
1.5. FUNKTIONALE ANALYSE VON ENYZMAKTIVITAETEN . 12
1.5.1. INHIBIERUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN IN MUTANTEN UND TRANSGENEN
PFLANZEN 12
1.5.2. UEBEREXPRESSION VON ENZYMAKTIVITAETEN 16
1.6. ETHISCHE BETRACHTUNG TRANSGENER PFLANZEN 18
1.7. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 19
II. MATERIAL 20
20
20
21
21
22
22
23
23
23
II. 1.
N.2.
U.3.
II.4.
II.5.
N.6.
II.7.
N.8.
H.9.
CHEMIKALIEN UND ENZYME
MATERIAL UND GERAETE
OLIGONUKLEOTIDE
BAKTERIENSTAEMME
VEKTOREN UND PLASMIDE
POLYKLONALE ANTIKOERPER
CDNA-BAENKE
MEDIEN
PFLANZEN
IMAGE 3
III. METHODEN 24
ULI. ISOLIERUNG STAERKEKORN-GEBUNDENER PROTEINE 24
111.2. AUFREINIGUNG LOESLICHER STAERKE-SYNTHASEN AUS KARTOFFELKNOLLEN 24
IN.2.1. ROHEXTRAKT 24
HI.2.2. DEAE-CHROMATOGRAPHIE 24
111.2.3. AMYLOSE- RESIN -CHROMATOGRAPHIE 25
111.2.4. MONO-Q-CHROMATOGRAPHIE 25
111.3. KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG 25
M.4. PCR-AMPLIFIKATION 25
111.5. TRANSFORMATIONEN 26
111.6. PFLANZENHALTUNG 26
111.7. SOUTHERN-BLOT -ANALYSE 26
111.8. NORTHERN-BLOT -ANALYSE 27
111.9. DURCHMUSTERUNG VON CDNA-BAENKEN MIT HOMOLOGEN ODER HETEROLOGEN
DNA-SONDEN 27
IN. 10. DURCHMUSTERUNG VON CDNA-BAENKEN MIT POLYKLONALEN ANTIKOERPERN 27
M.11. PROTEINANALYSE 28
III. 11.1. PROTEINBESTIMMUNG 28
III. 11.2. SDS-PAGE 28
M.11.3. WESTERN-BLOT -ANALYSE 28
III. 12. NACHWEIS VON ENZYMAKTIVITAETEN 28
III. 12.1. RADIOAKTIVE BESTIMMUNG DER STAERKE-SYNTHASE-AKTIVITAET 28
HI.12.2. NACHWEIS VON LOESLICHEN STAERKE-SYNTHASEN IM NATIVEN GEL 29
IUE.12.3. NACHWEIS VON STPII UND VERZWEIGUNGSENZYM IN EINEM NATIVEN GEL
29
111.13. QUANTIFIZIERUNG VON RADIOAKTIVEN SIGNALEN 29
111.14. IN VITRO SYNTHESE VON A-L,4-GLUKANEN 29
111.15. BESTIMMUNG DES XROAX VON IN VITRO PRODUZIERTEN A-L,4-GLUKANEN 30
111.16. BESTIMMUNG VON STAERKE UND LOESLICHEN ZUCKERN 30
NI.17. STAERKEANALYSE 30
III.17.1. BESTIMMUNG DER STAERKEZUSAMMENSETZUNG 30
III. 17.2. ANALYSE DER SEITENKETTENLAENGENVERTEILUNG VON STAERKE 31
III. 17.3. BESTIMMUNG DES PHOSPHORYLIERUNGSGRADES VON STAERKE 31
IMAGE 4
DI.17.4. VISKOSITAETSMESSUNG 31
UEI.17.5. MESSUNG DER ABSORPTION EINES STAERKEKLEISTERS 32
III. 17.6. ANALYSE DER STAERKEKORNGROESSENVERTEILUNG 32
M.18. MIKROSKOPIE VON STAERKEKOERNERN 32
IV. ERGEBNISSE 33
IV. 1. AUFREINIGUNG UND IDENTIFIZIERUNG LOESLICHER STAERKE-SYNTHASEN AUS
KARTOFFELKNOLLEN 33
IV.2. KLONIERUNG VON CDNA-KLONEN, DIE FUER DREI STAERKE-SYNTHASE-ISOFORMEN
AUS KARTOFFEL KODIEREN 41
IV.2.1. KLONIERUNG EINER FUER DIE GBSS II AUS KARTOFFEL KODIERENDEN
VOLLAENGEN- CDNA 41
IV.2.1.1. SEQUENZANALYSE DER GBSS II-KODIERENDEN CDNA 41
IV.2.2. KLONIERUNG EINER CDNA, DIE FUER DIE LOESLICHE STAERKE-SYNTHASE IH
AUS
KARTOFFEL KODIERT * 44
IV.2.2.1. SEQUENZANALYSE DER SSS FFL-KODIERENDEN CDNA 45
IV.2.3. KLONIERUNG EINER CDNA, DIE FUER DIE LOESLICHE STAERKE-SYNTHASE I
AUS
KARTOFFEL KODIERT 48
IV.2.3.1. SEQUENZANALYSE DER SSS I-KODIERENDEN CDNA 49
IV.2.4. SEQUENZVERGLEICH VON SSS I, SSS IN UND GBSS U 52
IV.3. IMMUNOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON STAERKEKORN-GEBUNDENEN
SYNTHASEN IN SPEICHERORGANEN VERSCHIEDENER PFLANZENARTEN 54
IV.4. EXPRESSIONSANALYSE VON GENEN, DIE FUER LOESLICHE UND STAERKEKORN-
GEBUNDENE STAERKE-SYNTHASEN AUS KARTOFFEL KODIEREN 56
FV.4.1. EXPRESSION DER FUER STAERKE-SYNTHASEN-KODIERENDEN GENE IN ORGANEN
DER KARTOFFELPFLANZE 56
IV.4.2. INDUKTION DER EXPRESSION VON STAERKE-SYNTHASE-KODIERENDEN GENEN
DURCH SACCHAROSE 57
IV.5. FUNKTIONALE ANALYSE DER STAERKE-SYNTHASEN SSS I, GBSS II UND SSS M
MIT HILFE VON ANTISENSE -PFLANZEN 59
IV.5.1. AUFFINDEN VON KARTOFFELPFLANZEN MIT REDUZIERTEM GEHALT AN
STAERKE- SYNTHASE-KODIERENDER MRNA 60
IV.5.2. NACHWEIS VON REDUZIERTEM GEHALT AN STAERKE-SYNTHASE-PROTEIN IN
KNOLLEN VON ANTISENSE -INHIBIERTEN KARTOFFELPFLANZEN 62
IMAGE 5
IV.5.3. UNTERSUCHUNG DER EINE REDUZIERTE MENGE AN STAERKE-SYNTHASE MRNA
UND PROTEIN AUFWEISENDEN TRANSGENEN PFLANZEN AUF REDUZIERTE STAERKE-
SYNTHASE-AKTIVITAET 63
IV.5.4. QUANTIFIZIERUNG DER STAERKE-SYNTHASE-AKTIVITAET IN
STAERKE-SYNTHASE- ANTISENSE -PFLANZEN 65 _
IV.5.5. EINFLUSS DER INHIBIERUNG VON STAERKE-SYNTHASE-ISOFORMEN AUF DEN
KNOLLENERTRAG, STAERKE- UND SACCHAROSEGEHALT SOWIE DEN PHAENOTYP DER
TRANSGENEN PFLANZEN 67
IV.5.6. STAERKE-ANALYTIK: NACHWEIS VON VERAENDERUNGEN DER STAERKEQUALITAET
IN
STAERKE-SYNTHASE- ANTISENSE -PFLANZEN 67
IV.5.6.1. UNTERSUCHUNG DER STAERKE AUS SSS I- ANTISENSE -PFLANZEN 68
IV.5.6.2. UNTERSUCHUNG DER STAERKE AUS GBSS N- ANTISENSE -PFLANZEN 70
IV.5.6.3. UNTERSUCHUNG DER STAERKE AUS SSS NI- ANTISENSE -PFLANZEN 72
IV.7. CHARAKTERISIERUNG DER STAERKE-SYNTHASE-ISOFORMEN I UND EI IN E.
COLI 76
IV.7.1. EXPRESSION VON SSS I, SSS IN, GBSS I, GBSS H UND GLYKOGEN-
SYNTHASE IN EINER MUTANTE VON E. COLI 76
IV.7.2. FUNKTIONALE CHARAKTERISIERUNG VON SSS I UND HI IN VITRO 81
V. DISKUSSION 84
V. 1. AUFREINIGUNG VON LOESLICHEN STAERKE-SYNTHASEN AUS KARTOFFELKNOLLEN
84
V.2. KLONIERUNG UND SEQUENZANALYSE VON CDNA-KLONEN, DIE FUER DREI STAERKE-
SYNTHASE-ISOFORMEN AUS KARTOFFEL KODIEREN 86
V.3. EXPRESSIONSMUSTER DER STAERKE-SYNTHASE-KODIERENDEN GENE 88
V.4. FUNKTIONALE ANALYSE DER STAERKE-SYNTHASE-ISOFORMEN MIT HILFE VON
ANTISENSE -PFLANZEN 90
V.4.1. STAERKE-SYNTHASE- ANTISENSE -PFLANZEN 90
V.4.2. CHARAKTERISIERUNG DER STAERKE AUS
STAERKE-SYNTHASE- ANTISENSE -PFLANZEN 92
VI. ZUSAMMENFASSUNG 96
VII. LITERATURVERZEICHNIS 98
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