Heterologe Expression von Apo-Phytochromen aus Solanum tuberosum und spektroskopische Charakterisierung der rekonstituierten Holo-Proteine:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Mülheim an der Ruhr
Max-Planck-Inst. für Strahlenchemie
1996
|
| Schriftenreihe: | Max-Planck-Institut für Strahlenchemie <Mülheim, Ruhr>: Schriftenreihe des Max-Planck-Instituts für Strahlenchemie
95 |
| Schlagworte: | |
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| Beschreibung: | Zugl.: Bielefeld, Univ., Diss., 1996 |
| Beschreibung: | 156 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DAS
PROTEIN
.
1
1.2
DER
CHROMOPHOR
.
5
1.3
DIE
BIOSYNTHESE
VON
CHROMOPHOR
UND
PROTEIN
.
6
1.4
DIE
P
R
-
P
(R
PHOTOKONVERSION
.
7
1.5
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER PHYTOCHROME
.
9
1.6
DIE
SIGNALTRANSDUKTION
VON
PHYTOCHROM
.
11
1.7
REKOMBINANTES
PHYTOCHROM
.
13
1.8
ZIELE
DER
ARBEIT
.
16
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
17
2.1
BAKTERIENSTAEMME
.
17
2.2
HEFEN
.
17
2.3
OLIGONUKLEOTIDE
.
18
2.4
HERKUNFT
DER
REAGENTIEN
UND
ENZYME
.
19
2.5
MEDIEN
.
19
2.6
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
21
2.7
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
23
2.7.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
2
ML
KULTUREN
(KLONANALYSEN).
23
2.7.2
PRAEPARATIVE
PLASMID-ISOLIERUNG
.
23
2.7.3
ISOLIERUNG
VON
EINZELSTRAENGIGER
DNA
.
24
2.8
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
.
24
2.8.1
ISOLIERUNG
URACILHALTIGER,
EINZELSTRAENGIGER
(TEMP/ATE)
DNA
.
24
2.8.2
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
25
2.8.3
HYBRIDISIERUNG
DES
OLIGONUKLEOTIDS
AN
DAS
TEMPLATE
.
25
2.8.4
SYNTHESE
DES
ZWEITEN
STRANGES
.
25
2.8.5
TRANSFORMATION
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMANDEN
.
25
2.9
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
26
2.10
DNA-SEQUENZIERUNG
.
26
2.11
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
27
2.11.1
PRAEPARATION
VON
BAKTERIENZELLEN
FUER
DIE
CACI
2
-TRANSFORMATION
.
27
2.11.2
TRANSFORMATION
MIT
DER
CACI
2
-METHODE
.
27
2.11.3 PRAEPARATION
VON
BAKTERIENZELLEN
FUER
DIE
ELEKTROPORATION
.
27
2.11.4
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
.
27
2.12
GELELEKTROPHORESE
.
28
2.12.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE.
.
28
2.12.2
FAERBUNG
VON
DNA
MIT
ACRIDINORANGE
.28
2.12.3
POLAYCRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
28
2.13
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
29
2.13.1
RESTRIKTION
VON
DNA
.
29
2.13.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
LM-AGAROSE.
29
2.13.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
29
2.13.4
PRAEPARATION
VON
VEKTOREN
.
30
2.13.5
LIGATION
.
30
2.14
HYBRIDISIERUNG
VON
OLIGPNUKLEOTIDEN
.
30
2.14
1
HYBRIDISIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDKASSETTE
.
30
2.12.2
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
.
30
2.15
TRANSFORMATION
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
31
2.15.1
PRAEPARATION
VON
ELEKTROKOMPETENTEN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
31
2.15.2
TRANSFORMATION
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
DURCH
ELEKTROPORATION
.
31
2.16
SPHAEROPLASTENTRANSFORMATION
VON
PICHIA
PASTORIS
.
31
2.17
EXPRESSION
VON
PGEX5X1-PHYB
FUSIONSPROTEINEN
IN
E.
COLI
.
32
2.17.1
INDUKTION
UND
AUFSCHLUSS
VON
500
ML
KULTUREN
.
32
2.17.2
ABSPALTUNG
DES
PROTEINS
VOM
FUSIONSANTEILS.
33
2.17.3
ELUTION
DES
GESAMTEN
FUSIONSPROTEINS
.
33
2.18
EXPRESSION
VON
PHYTOCHROM
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
33
2.19
EXPRESSION
VON
PHYTOCHROM
IN
PICHIA
PASTORIS
.
34
2.20
ISOLIERUNG
VON
PHYTOCHROM
.
35
2.20.1
FRENCH-PRESS
.
35
2.20.2
ULTRA-TURRAX
.
34
2.21
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
NACH
BRADFORD
.
35
2.22
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
35
2.23
WESTERN
BLOT
.
35
2.24
ZINK
BLOT
.
36
2.25
REKONSTITUTION
VON
APOPHYTOCHROM
UND
CHROMOPHOR
.
36
2.25.1
CHROMOPHOREINBAU
UND
PHOTOKONVERSION
.
36
2.25.2 KINETIK
DES
CHROMOPHOREINBAUS
.
37
2.25.3
P
FR
-
P
R
DUNKEIREVERSION
.
37
2.26
LASER-BLITZPHOTOLYSE
.
37
2.26.1
VERSUCHSAUFBAU
.
37
2.26.2
SIGNALAUFNAHME
.40
2.26.3
MESSUNG
DER
ENERGIEABHAENGIGKEIT
.
41
2.26.4
DATENAUSWERTUNG.
41
3.
ERGEBNISSE
43
3.1
DAS
125
KDA-PHYTOCHROM
B
.
43
3.1.1
DIESEQUENZ
.43
3.1.2
KLONIERUNG
DES
VOLLAENGEN
PHYTOCHROMS
.46
3.1.3
DIE
EXPRESSION
VON
PHYTOCHROM
B
.48
3.1.3.1
EXPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREV/SZAE
.
48
3.1.3.2 EXPRESSION
IN
PICHIA
PASTORIS
.
52
3.1.3.3
EXPRESSION
IN
ESCHERICHIA
COLI.
.
54
3.1.4
SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
PHYB
125
KDA-PROTEMS.
56
3.1.5
UNTERSUCHUNG
DER
P
R
-P
FR
PHOTOKONVERSION
MIT
DER
BLITZPHOTOLYSE.
59
3.1.5.1
DIE
ENERGIEABHAENGIGKEIT
DES
SIGNALS
.
60
3.1.5.2
DER
L
700
-ZERFALL
.
62
3.1.5.3
DIE
PFR-ENTSTEHUNG
.
67
3.1.6
DIE
PF,-
P
R
DUNKEIREVERSION
.
73
3.2
DAS
66
KDA-PHYTOCHROM
B
.
75
3.2.1
DAS
PLASMID
.
75
3.2.2
DIE
EXPRESSION
VON
PHYB66
.
76
3.2.3
DER
CHROMOPHOREINBAU
.
77
3.2.4
ZINK-BLOT
.
80
3.2.5
SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PHYB66
.
81
3.2.6
UNTERSUCHUNG
DER
P
R
-P
FR
PHOTOKONVERSION
MIT
DER
BLITZPHOTOLYSE.
83
3.2.6.1
DIE
ENERGIEABHAENGIGKEIT
DES
SIGNALS
.
83
3.2.6.1
DER
L
700
ZERFALL
VON
PHYB66.
85
3.2.6.2
DIE
P
FR
-ENTSTEHUNG
VON
PHYB66
.
89
3.2.7
DIE
P^P.-DUNKELREVERSION
VON
PHYB66.
92
3.3
DAS
118
KDA-PHYTOCHROM
B
.
95
3.3.1
DAS
PLASMID
.
95
3.3.2
DIE
EXPRESSION
VON
PHYBA74
.
97
3.3.3
SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PHYBA74
.
98
3.4
PHYTOCHROM
A
.
100
3.4.1
DAS
PLASMID.
100
3.4.2
EXPRESSION
VON
PHYTOCHROM
A
.
102
3.4.3
SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PHYTOCHROM
A
.
104
3.4.4
DIE
P
FR
-
P
FT
DUNKEIREVERSION
VON
PHYTOCHROM
A
.
106
4.
DISKUSSION
109
4.1
DIE
EXPRESSION
VON
APOPHYTOCHROM
.
109
4.2
SPEKTROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
PHYTOCHROME
.
111
4.2.1
DER
CHROMOPHOREINBAU
.
111
4.2.2
DIFFERENZABSORPTIONSSPEKTREN
VON
PHYTOCHROMEN
.
114
4.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEINE
DURCH
IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISE
UND
ZINK-FLUORESZENZ
ANALYSE
.
121
4.3
DIE
REAKTIONSKINETIK
DER
P,
-+
P
FT
PHOTOKONVERSION
.
122
4.3.1
REAKTIONEN
IM
PS-ZEITBEREICH
.
122
4.3.2
REAKTIONEN
IN
MS-ZEITBEREICH
.
124
4.4
DIE
PF,
-YY
P,
DUNKEIREVERSION
.
128
5.
ZUSAMMENFASSUNG
133
6.
LITERATURVERZEICHNIS
137
ANHANG
150
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
150
TABELLENVERZEICHNIS
.
153
ABKUERZUNGEN
.
154
EIN-BUCHSTABEN-SYMBOLE
DER
AMINOSAEUREN
.
156 |
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