Bedeutung von HER3 für die Signaldefinition von HER2:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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1.
EINLEITUNG
1
1.1.
STRUKTUR
VON
REZEPTORTYROSINKINASEN
.
1
1.2.
REZEPTORDIMERISIERUNG
UND
SIGNALUEBERTRAGUNG
.
3
1.2.1.
SIGNALPROTEINE
MIT
KATALYTISCHER
AKTIVITAET
.
7
1.2.2.
SIGNALPROTEINE
OHNE
KATALYTISCHE
AKTIVITAET.
.
8
1.2.3.
SIGNALPROTEINE,
DIE
UNABHAENGIG
VON
SH2
DOMAENEN
AN
RTKS
BINDEN
KOENNEN
.
9
1.3.
DIE
EGF-REZEPTOR
FAMILIE
.
10
1.4.
LIGANDEN
DER
EGF-REZEPTOR
FAMILIE
.
12
1.5.
ZIELSETZUNG
.
15
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
IE
2.1.
BEZUGSQUELLENNACHWEIS
.
16
2.1.1.
CHEMIKALIEN
.
16
2.1.2.
ENZYME
.
17
2.1.3.
RADIOCHEMIKALIEN
.
17
2.1.4.
"KITS"
UND
SONSTIGES
.
18
2.2.
MEDIEN
UND
PUFFER
.
18
2.2.1.
MEDIEN
FUER
E.COLI
BAKTERIEN
.
18
2.2.2.
ZELLKULTURMEDIEN
.
19
2.2.3.
STAMMLOESUNGEN
UND
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
.
20
2.3.
BAKTERIENSTAEMME,
ZELLINIEN
UND
ANTIKOERPER
.
21
2.3.1.
BAKTERIENSTAEMME
.
22
2.3.2.
ZELLINIEN
.
22
2.3.2.1.
HUMANE
ZELLINIEN
.
22
2.3.2.2.
ANDERE
ZELLINIEN
.
23
2.3.2.3.
VIRUSPRODUZIERENDE
ZELLINIEN
.
23
2.
3.3.
ANTIKOERPER.
.
25
2.4.
PLASMIDVEKTOREN
UND
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
2.4.1.
AUSGANGSVEKTOREN
.
26
2.4.2.
IM
RAHMEN
DIESER
ARBEIT
VERWENDETE
VEKTOREN
.
27
2.4.3.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
33
2.5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
39
2.5.1.
PLASMIDPRAEPARATION
FUER
ANALYTISCHE
ZWECKE
.
39
2.5.2.
PLASMIDPRAEPARATION
FUER
PRAEPARATIVE
ZWECKE
.
39
2.5.3.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
39
2.5.3.1.
VERDAU
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
39
2.5.3
2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-ENDEN
.
40
2
5.3.3.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-ENDEN
.
40
2.5.3.4.
VERKNUEPFUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
.
40
2.5.3.4.1.
STANDARD
LIGATION
(FRAGMENTE
2KB)
.
40
2.5.3.4.2.
"
RAPID
LIGATION
"
(FRAGMENTE
2KB)
.
41
2.5.4.
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
41
2.5
4.1.
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
EINEM
AGAROSEGEL
.
41
2.5.4.2.
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
EINEM
POLYACRYLAMIDGEL
.
41
2.5.5.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
41
2.5.5.1.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN.41
2.5.5.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
.
41
2.5.6.
DNA-TRANSFER
IN
E.COLI
BAKTERIEN
.
42
2.5.6.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
BAKTERIEN
.
42
2.5.6.2.
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
E.COLI
BAKTERIEN
.
42
2.5.7.
DAUERKULTUREN
VON
E.COLI
BAKTERIEN
.
42
2.5.8.
SEQUENZIERUNG
.
42
2.5.9.
DNA-MUTAGENESE
.
42
2.5.9.1.
HERSTELLUNG
VON
URACILHALTIGER
EINZELSTRANG
M
13
DNA
.
43
2.5.9.2.
SYNTHESE
DES
MUTIERTEN
DNA-STRANGES
.
43
2.6.
ARBEITEN
MIT
RNA
.
43
2.6.1.
PRAEPARATION
VON
RNA
.
44
2.6.2.
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
RNA
.
44
2.6.3.
NORTHERN
ANALYSE
.
44
2.6.3.1.
TRANSFER
VON
RNA
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
.
44
2.6.3.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
[A
32
P]-DATP
.
45
2.6.3.3.
HYBRIDISIERUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROBEN
MIT
RNA.
.45
2.7.
AMPLIFIKATION
VON
RNA
UND
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
PCR
.
46
2.7.1.
CDNA-SYNTHESE.
46
2.7.2.
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
UND
CDNA
FRAGMENTEN
.
46
2.7.3.
RT-PCR
.
47
2.7.4.
AUFREINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
48
2.7.5.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
48
2.7.5.1.
HERKOEMMLICHE
KLONIERUNG
.
48
2.7.5.2.
KLONIERUNG
MIT
DEM
CLONEAMPYY
SYSTEM
.
48
2.8.
PROTEINANALYTISCHE
METHODEN
.
49
2.8.1.
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
EINES
GLUTATHION-S
TRANSFERASE
(GS
T)-FUSIONSPROTEINS
.
49
2.8.1.1.
EXPRESSION
EINES
GST-FUSIONSPROTEINS
IN
BAKTERIEN.,49
2.8.1.2.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
GLUTATHION-SEPHAROSE.,49
2.8.2.
LYSE
VON
ZELLEN
MIT
TRITON
X-100
.
50
2.8.3.
PROTEINBESTIMMUNG
.
50
2.8.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
.
51
2.8.5.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
51
2.8.6.
FAERBUNG
UND
FIXIERUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
52
2.8.7.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
.
52
2.8.8.
IMMUNDETEKTION
(WESTEM-BLOT
ANALYSE)
.
52
2.8.9.
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
ASSOZIATIONEN
.
53
2.8.9.1.
IN
VITRO
ASSOZIATION
.
53
2.8.9.2.
IN
VIVO
ASSOZIATION
.
53
2.8.10.
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
PHOSPHATIDYLINOSITOL-3-KINASE
(PI3-KINASE
ASSAY)
.
54
2.9.
METHODEN
ZUR
ARBEIT
MIT
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
54
2.9.1.
ALLGEMEINE
ZELLKULTURTECHNIKEN
.
54
2.9.2.
MYKOPLASMENTEST.
54
2.9.3.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
RETROVIREN
.
55
2.9
3.1
ELEKTROPORATION
VON
PA317
.
55
2.9.3.2.
HERSTELLUNG
STABILER
VIRUS-PRODUZIERENDER
GP+E
86
ZELLINIEN
.
56
2.9.3.2.1.
INFEKTION
VON
GP+E
86
ZELLEN
MIT
AMPHOTROPHEN
VIREN
VON
PA317
ZELLEN
.
56
2.9.3.2.2.
TITERBSTIMMUNG
VON
VIRUS-PRODUZIERENDEN
GP+E
86
KLONEN
.
56
2.9.4.
RETROVIRALER
GENTRANSFER
IN
NAGERZELLINIEN
.
57
2.9
5.
BILDUNG
VON
KOLONIEN
IM
WEICHAGAR
(YYSOFT
AGAR
ASSAY
"
)
.
57
2.9.6.
NACHWEIS
DER
TRANSFORMATION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
DURCH
BILDUNG
VON
ZELLFOCI
(YYFOCUS
FORMATION
ASSAY")
.
57
2.9.
7.
YYPLATING
EFFICIENCY".
.
58
2.9.8.
UNTERSUCHUNG
DES
WACHSTUMS
VON
ZELLEN
(MTT-WACHSTUMSTEST)
.
58
2.9.9.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
ZELLEN
MIT
P
5
S]-L-METHIONIN
.
58
2.9.10.
STIMULATION
VON
ZELLEN
.
59
3.
ERGEBNISSE
.
60
3.1.
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DER
HER3
CDNA
.
60
3.1.1.
HERSTELLUNG
UND
EXPRESSION
EINER
EGF-REZEPTOR/HER3
CHIMAERE
.
63
3.
1.2.
DIE
REZEPTOR-CHIMAERE
HER1/3
KANN
P85
UND
SHC,
NICHT
ABER
GRB2,
GAP
ODER
PLCY
BINDEN
.
66
3.2.
HEREGULIN,
DER
LIGAND
VON
HER2
.
70
3.3.
KLONIERUNG
DER
EGF-AEHNLICHEN
DOMAENEN
VERSCHIEDENER
HEREGULIN
ISOFORMEN
.
71
3.4.
DIE
VERSCHIEDENEN
HRG-FUSIONSPROTEINE
INDUZIEREN
DIE
AKTIVIERUNG
VON
HER2
IN
MCF-7
ZELLEN,
NICHT
ABER
IM
293
ZELLSYSTEM
.
72
3.5.
EXPRESSION
VON
MITGLIEDERN
DER
EGF-REZEPTORFAMILIE
IN
OVARIAL
UND
MAMMAKARZINOMZELLINIEN
.
74
3.6.
HER3
WIRD
ZUR
HRG-ABHAENGIGEN
AKTIVIERUNG
VON
HER2
BENOETIGT
.
75
3.7.
BEI
DER
HETEROAKTIVIERUNG
VON
HER2
UND
HER3
LIEGT
EIN
UNIDIREKTIONALER
MECHANISMUS
VOR
.
78
3.8.
AUSWIRKUNGEN
DER
REZEPTOREXPRESSION
AUF
DIE
INDUZIERBARKEIT
DER
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
HER2
UND
HER3
.
80
3.9.
HEREGULIN
BEWIRKT
DIE
TRANSFORMATION
VON
NIH3T3
ZELLEN
DURCH
EINE
HER2-VERMITTELTE
TRANSAKTIVIERUNG
VON
HER3
.
82
3.10.
DAS
HETERODIMER
HER2/HER3
KANN
AN
VERSCHIEDENE
SIGNALKASKADEN
KOPPELN
.
84
3.11.
NEBEN
SHC
UND
P85
ASSOZIIEREN
NOCH
ANDERE
PROTEINE
MIT
HER3
NACH
HRG
STIMULATION
.
88
3.12.
GRB7
IST
MIT
HER3
NACH
HRG
STIMULATION
ASSOZIIERT
.
90
3.13.
P85,
SHC
UND
GRB7
HABEN
UNTERSCHIEDLICHE
AFFINITAETEN
ZU
AKTIVIERTEM
HER3
.
91
3.14.
ANALYSE
DER
FUER
DIE
SUBSTRATBINDUNG
VERANTWORTLICHEN
BINDUNGSSTELLEN
VON
HER3
.
92
3.14.1.
ERZEUGUNG
VON
VERSCHIEDENEN
HER3
CDNA
MUTANTEN
.
93
3.14.2.
SUBSTRATBINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
MUTANTEN
HER3
46,
47
UND
ASHC
IM
VERGLEICH
ZUM
WT
REZEPTOR.
.
95
3.14.3.
UNTERSUCHUNG
DER
EINZELNEN
P85
BINDUNGSMOTIVE
VON
HER3
.
96
3.
14.4.
DIE
HRG-ABHAENGIGE
TRANSFORMATION
VON
ZELLEN
DIE
HER2
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
HER3
MUTANTEN
(46,
47
UND
4SHC)
KOEXPRIMIEREN
IST
ZWAR
VERRINGERT,
KANN
ABER
NICHT
KOMPLETT
UNTERBUNDEN
WERDEN
.
99
3.15.
DIE
TRANSFORMATIONSKAPAZITAET
DES
HER2/HER3
HETERODIMERS
IST
HAUPTSAECHLICH
HER3
VERMITTELT
.
102
3.16.
HER3
ACT
INHIBIERT
DIE
HRG
INDUZIERTE
HER2
AKTIVIERUNG
.
103
4.
DISKUSSION
.
IOE
4.1.
HER3
BESITZT
KEINE
INTRINSISCHE
KINASEAKTIVITAET
.
106
4.2.
HRG-ABHAENGIGE
TRANSPHOSPHORYLIERUNG
BEWIRKT
DIE
AKTIVIERUNG
VON
HER3
UND
ERMOEGLICHT
DIE
REKRUTIERUNG
VON
SIGNALTRANSDUKTIONSMOLEKUELEN
.
108
4.3.
AKTIVIERUNG
VON
HER2
.
113
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
115
6.
LITERATUR
.
NS
7.
ABKUERZUNGEN
.
130 |
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