Die transkriptionelle Regulation des humanen Interzellulären Zelladhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1):
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1.1.
ZELLADHAESIONSMOLEKUELE
1.2.
DAS
INTERZELLULAERE
ADHAESIONSMOLEKUEL
1
(ICAM-1
)
1.3.
DIE
ICAM-1
LIGANDEN
1.4.
DIE
FUNKTIONEN
VON
ICAM-1
1.5.
DIE
EXPRESSIONSREGULATION
2.
MATERIAL
2.1.
REAGENTIEN
2.2.
AUSGANGSSTOFFE
FUER
KULTURMEDIEN
2.3.
ENZYME
2.4.
RADIOCHEMIKALIEN
2.5.
GERAETE
2.6.
VERBRAUCHSMATERIAL
2.7.
NUKLEINSAEUREN
2.8.
GROESSENSTANDARDS
2.9.
WIRTSBAKTERIEN
UND
ZELLINIEN
2.10.
PLASMIDE
UND
GENOMISCHE
KLONE
2.11.
OLIGONUKLEOTIDE
2.13.
KULTURMEDIEN
2.14.
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
3.
METHODEN
3.1.
ZELLKULTUR
3.1.1.
ZYTOKINBEHANDLUNG
3.2.
KRYOKONSERVIERUNG
UND
AUFTAUEN
VON
SAEUGERZELLEN
3.3.
MYKOPLASMENTEST
3.4.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
BAKTERIEN
3.5.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
BAKTERIEN
3.6.
HERSTELLUNG
VON
BAKTERIENSTAMMLOESUNGEN
3.7.
AUFBEREITUNG VON
E.
COLI
BAKTERIEN
FUER
PHAGENINFEKTIONEN
3.8.
INFEKTION
VON
E.
COLI
WIRTSBAKTERIEN
MIT
LAMBDAPHAGEN
3.9.
HERSTELLUNG
VON
LAMBDAPHAGENSTAMMLOESUNGEN
3.10.
PHENOLEXTRAKTION
3.11.
ETHANOLPRAEZIPITATION
VON
DNA
3.12.
PRAEPARATION
VON
LAMBDAPHAGEN-DNA
AUS
PLATTENLYSATEN
3.13.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA
3.14.
DNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE
3.15.
VERDAU
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
3.16.
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
PLASMIDVEKTOREN
SEITE
1
1
2
2
3
5
7
7
8
9
9
9
10
10
10
10
11
12
13
14
15
15
15
15
16
16
16
17
17
17
17
18
18
18
19
19
19
19
INHALTSVERZEICHNIS
3.17.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
20
3.18.
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
20
3.18.1.
ALKALISCHE
LYSE
20
3.18.2.
AFFNINITAETSSAEULEN
21
3.19.
MAXIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(ALKALISCHE
LYSE)
21
3.20.
CAESIUMCHLORID-ETHIDIUMBROMID
GLEICHGEWICHTSZENTRIFUGATION
21
3.21.
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
EUKARYONTENZELLEN
22
3.21.1.
GT-METHODE
22
3.21.2.
PRAEPARATION
MIT
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIESAEULEN
22
3.22.
RNA-PRAEPARATION
22
3.23.
SOUTHERN-BLOTS
23
3.24.
DENATURIERENDE
RNA-AGAROSEGELE
23
3.25.
NORTHERN-BLOTS
24
3.26.
RANDOM
PRIMER-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
24
3.27.
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
TDT
25
3.28.
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN
UND
NORTHERN-BLOTS
25
3.28.1.
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIVMARKIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
25
3.28.2.
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIVMARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
25
3.29.
BERECHNUNG
DER
HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUR
FUER
OLIGOS
26
3.30.
ELEKTROPHORESE
AUF
DEAE-ZELLULOSEMEMBRANEN
26
3.31.
TURBO-KOLONIESCREENING
27
3.32.
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
27
3.32.1.
TRANSFEKTION
MIT
"TRANSFERRINFECTION"
27
3.32.2.
TRANSFEKTION
MIT
"LIPOFEKTIN"
28
3.33.
HERSTELLUNG
VON
ZYTOSPINPRAEPARATEN
29
3.34.
IMMUNPEROXIDASEFAERBUNG
VON
ZYTOSPINPRAEPARATEN
29
3.35.
IMMUNFLUORESZENZ
29
3.36.
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
30
3.37.
LUZIFERASEASSAYS
30
3.38.
BESTIMMUNG
VON
PROTEINMENGEN
31
3.39.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
MIT
TAQ-POLYMERASE
31
3.39.1.
PCR
VON
BAKTERIENKOLONIEN
31
3.40.
DNA-SEQUENZIERUNG
32
3.40.1.
6%-POLYACRYLAMID-HARNSTOFF-SEQUENZIERGELE
32
3.40.2.
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
MIT
SEQUENASE
33
3.40.3.
SEQUENZIERUNG
MIT
DEM
"AUTOREAD
"
SEQUENZIERKIT
34
3.41.
ELEKTROMOBILITAETSSHIFTANALYSEN
(EMSA)
34
3.41.1.
PRAEPARATION
VON ZYTOPLASMA
UND
KERNEXTRAKTEN
34
3.41.2.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
35
3.41.3.
BINDUNGSREAKTION
35
3.41.4.
ANTIKOERPERBINDESTUDIEN
35
3.41.5.
ANNEALING
DER
OLIGONUKLEOTIDE
36
3.41.6.
MARKIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
MIT
KLENOW-ENZYM
36
3.42.
LIGATIONSVERMITTELTE
PCR
(LM-PCR)
36
3.42.1.
DNASEL
BEHANDLUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
GESCHNITTENEN
DNA
37
3.42.2.
ABLAUF
DER
LM-PCR
38
3.42.3.
ERSTSTRANGSYNTHESE
40
INHALTSVERZEICHNIS
3.42.4.
LIGATIONSREAKTION
40
3.42.5.
AMPLIFIKATION
41
3.42.6.
MARKIERUNG
42
3.42.7.
GELELEKTROPHORESE
43
3.43.
METHYLIERUNGSEXPERIMENTE
43
3.43.1.
5-AZACYTIDIN-BEHANDLUNG
43
3.43.2.
IN
VITRO
METHYLIERUNG
43
3.44.
TNF-REZEPTOR-BESTIMMUNG
43
4.
ERGEBNISSE
44
4.1.
DAS
HUMANE
ICAM-1
GEN
44
4.1.1.
ICAM
1
/REPORTERGENKONSTRUKTE
46
4.1.2.
KLONIERUNG
WEITERER
ICAM-1/LUZIFERASEPLASMIDE
47
4.2.
DIE
KONSTITUTIVE
EXPRESSION
DES
ICAM-1
GENS
49
4.2.1.
ZELLOBERFLAECHENEXPRESSION
50
4.2.2.
BESTIMMUNG
DER
ICAM-1
MRNA
MENGE
51
4.2.3.
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
VON
ICAM-1
REPORTERGENKONSTRUKTEN
52
4.2.3.1.
GROBANALYSE
DES
ICAM-1
PROMOTORBEREICHES
52
4.2.3.2.
FEINANALYSE
DES
ICAM-1
PROMOTORBEREICHES
56
4.2.4.
ANALYSE
DER
SP1/AP-2
REGION
62
4.2.4.1.
TRANSFEKTION
VON
MUTATIONSPLASMIDEN
62
4.2.4.2.
UNTERSUCHUNG
DER
SP1
UND
AP-2
MOTIVE
IN
BINDESTUDIEN
64
4.2.4.2.1.
DAS
SP1
BINDEMOTIV
64
4.2.4.2.2.
DAS
AP-2
BINDEMOTIV
66
4.2.5.
CHARAKTERISIERUNG
DES
INHIBITORS
ZWISCHEN
DEN
POSITIONEN
-339
UND
-290
68
4.2.5.1.
BINDESTUDIEN
MIT
DER
INHIBITORISCHEN
REGION
69
4.2.5.2.
KLONIERUNG
DER
REGION
ZWISCHEN
-339
UND
-290
VOR
EINEN
THYMIDINKINASEPROMOTOR
71
4.2.6.
DIE
ENHANCERREGION
STROMAUFWAERTS
VON
POSITION
-1620
72
4.2.6.1.
KLONIERUNG
DES
ENHANCERBEREICHES
UND
DER
REGION
DER
HYPERSENSITIVEN
STELLE
VOR
EINEN
THYMIDINKINASEPROMOTOR
73
4.2.7.
DIE
5'
UNTRANSLATIERTE
REGION
VON
ICAM-1
ENTHAELT
ALU-ELEMENTE
75
4.2.7.1.
KLONIERUNG
DER
ALU-ELEMENTE
VOR
DEN
THYMIDINKINASEPROMOTOR
77
4.2.7.2.
EMSAS
MIT
DEN
ALU-ELEMENTEN
78
4.2.8.
BINDUNG
VON
PROTEINEN
AUS
KERNEXTRAKTEN
UNINDUZIERTER
ZELLINIEN
AN
DIE
INHIBITORISCHE
REGION
ZWISCHEN
-189
UND
-174
79
4.2.9.
BINDESTUDIEN
MIT
DER
NF
K
B
BINDESTELLE
ZWISCHEN
-239
UND
-230
81
4.2.10.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
DES
GENOMISCHEN
ICAM-1
KLONS
HWB
3R1
82
4.2.11.
DIE
METHYLIERUNG
DES
ICAM-1
GENS
83
4.2.11.1.
EINFLUSS
VON
5-AZACYTIDIN
AUF
DIE
ICAM-1
ZELLOBERFLAECHENEXPRESSION
83
4.2.11.2.
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE DES
ICAM-1
PROMOTORS
84
4.2.11.3.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
METHYLIERTER
PLASMIDE
86
4.2.11.4.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
IN
DEMETHYLIERTE
ZELLEN
86
4.2.12.
UNTERSUCHUNG
DES
PROMOTORBEREICHES
MIT
LIGATIONSVERMITTELTER
PCR
(LM-PCR)
88
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.
DIE
INDUKTION
DES
HUMANEN
ICAM-1
GENS
92
4.3.1.
STIMULATION
DER
OBERFLAECHENEXPRESSION
VON
ICAM-1
DURCH
TNF-A,
IFN-Y
UND
EINE
KOMBINATION
VON
BEIDEN
92
4.3.2.
TRANSKRIPTIONELLE
REGULATION
DER
TNF-A
UND
IFN-Y
INDUKTION
95
4.3.3.
BESTIMMUNG
DER
TNF-A
BINDUNG
UNTER
DEM
EINFLUSS
VON
IFN-Y
96
4.3.4.
IDENTIFIZIERUNG
DER
PROMOTORBEREICHE,
DIE
FUER
DIE
INDUKTION
DURCH
IFN-YODER
TNF-A
VERANTWORTLICH
SIND
97
4.3.5.
UNTERSUCHUNG
DER
ELEMENTE,
DIE
FUER
TNF-A
ODER
IFN-Y
VERANTWORTLICH
SIND
IN
BINDUNGSSTUDIEN
(EMSA)
99
4.3.5.1.
DAS
NF
K
B
MOTIV
99
4.3.5.2.
DIE
IRE
SEQUENZ
102
4.3.5.3.
DIE
ICAM-1/IRE-SEQUENZ
UNTER
IFN-A
EINFLUSS
103
5.
DISKUSSION
106
5.1.
DIE
KONSTITUTIVE
ICAM-1
EXPRESSION
106
5.1.1.
DIE
REGULATION
DER
KONSTITUTIVEN
ICAM-1
EXPRESSION
106
5.1.2.
TRANSKRIPTIONSSTANS
UND
TATA-BOXEN
107
5.1.3.
DIE
REGIONEN
VON
-107
BIS
-34
UND
-174
BIS
-135
109
5.1.4.
DER
EINFLUSS
DER
ALU-REGION
112
5.1.5.
DIE
INHIBITORISCHE
REGION
ZWISCHEN
-339
UND
-290
114
5.1.6.
DIE
REGIONEN
-277Z-227
UND
-189/-174
116
5.1.7.
METHYLIERUNGEINFLUESSE
118
5.1.8.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
KONSTITUTIVEN
EXPRESSION
119
5.2.
DIE
INDUZIERTE
EXPRESSION
DURCH
IFN-Y
UND
TNF-A
122
5.2.1.
DAS
INTERFERONRESPONDIERENDE
ELEMENT
(IRE)
123
5.2.2.
DAS
NF
K
B
MOTIV
VON
-187
BIS
-178
UNTER
TNF-A
EINFLUSS
124
5.2.3.
DIE
SYNERGISTISCHE
AKTIVIERUNG
125
6.
ZUSAMMENFASSUNG
127
7.
REFERENZEN
129
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