Regulatorische Aspekte bei der Expression des xyl-Operons aus Bacillus megaterium:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
IV
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
.
2
2.1.
TRANSKRIPTIONSREGULATION
OBER
MEHRERE
OPERATOREN
.
2
2.2.
REGULATION
DES
KOHLENSTOFF
METABOLISMUS
IN
GRAM-NEGATIVEN
BAKTERIEN
.
2
2.2.1.
KATABOLITREPRESSION
.
3
2.2.2.
INDUKTORAUSSCHLUSS
.
3
2.3.
REGULATION
DES
KOHLENSTOFF
METABOLISMUS
IN
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
.
4
2.3.1.
KATABOLITREPRESSION
IN
BACILLUS
.
4
2
3
2
KATABOLITREPRESSION
IN
STREPTOMYCES
COEHCOLOR
.
6
2.3.3.
INDUKTORAUSSCHLUSS
IN
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
.
7
2.4.
REGULATION
DER
XYLOSEVENVERTUNG
IN
BACILLUS
MEGATERIUM
.
8
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
11
3.1.
MATERIAL
.
11
3.2.
VERWENDETE
BAKTERICNSTIIMMC
UND
PLASMIDE
.
14
3.3.
PUFFER
UND
MEDIEN
.
16
3
3
1.
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
16
3
3
2.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
GELCLEKTROPHORESE
.
16
3
3.3.
GROESSENSTANDARDS
FUER
DIE
GELELCKTROPHORESE
.
16
3.3.4.
BAKTERIENNAEHRMEDIEN
.
17
3.4.
METHODEN
.
18
3.4
1.
ALLGEMEINE
METHODEN
.
18
3
4.2.
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
UND
BESTIMMUNG
VON
GENCRATIONSZEITEN
.
18
3
4.3.
PRAEPARATION
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
BACILLUS
MEGATERIUM
.
19
3
4
4.
TRANSFORMATION
VON
BACILLUS
MEGATERIUM
PROTOPLASTEN
.
19
3.4.5.
PRAEPARATION
DES
LOESLICHEN
GESAMTPROTEINS
AUS
BACILLUS
MEGATERIUM
.
20
3.4.6.
MODIFIZIERUNGSMETHODCN
VON
DNA
.
20
3
4.6.1
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
20
3
4.6.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
.
20
3.4.6.3.
PRAEPARATION
VON
5
'
RADIOAKTIV
ENDMARKIERTEN
DNA
FRAGMENTEN
.
21
3.4.7.
ENZYMAKTIVITAETSMESSUNGEN
.
21
3.4.7.I.
SS-GALAKTOSIDASE
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
21
3
4
7.2.
SS-XYLOSIDASE
AKTIVITAETSBESTIMMUNGEN
.
21
3.4
7.3.
XYLOSEAUFNAHMEMESSUNGEN
.
22
3
4.7.4.
GLUCOSEAUFNAHMEMESSUNGEN
.
22
3.4.8.
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
VON
ZUCKERKONZENTRATIONEN
IM
MEDIUM
.
22
3.4.8.1.
BESTIMMUNG
DER
XYLOSEKONZENTRATION
IM
MEDIUM
.
22
3.4
8.2.
BESTIMMUNG
DER
GLUCOSCKONZENTRATION
IM
MEDIUM
.
23
3.4
9.
METHODEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
PROTEIN-DNA
WECHSELWIRKUNGEN
.
23
3.4.9.1.
DNA
RETARDATIONSEXPERIMENTE
.
23
3.4.9.2.
DMS-SCHUTZEXPERIMENTE
.
24
3
4.9.3.
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
.
24
INHALTSVERZEICHNIS
UE
4.
ERGEBNISSE
.
25
4.1.
KONSTRUKTION
VON
B.
MEGATERIUM
STAEMMEN
MIT
CHROMOSOMALEN
XYLA-LACZ
FUSIONEN
IN
EINEM
XYL+
HINTERGRUND
.
25
4.1.1.
KONSTRUKTION
VON
B.
MEGATERIUM
STAEMMEN
MIT
XYLA-LACZ
FUSIONEN
AM
GDH2
GENORT
.
25
4.1.1.1.
KLONIERUNG
VON
INTEGRATIVEN
PLASMIDEN
MIT
XYLA-LACZ
FUSIONEN
HINTER
DEM
GDH2
GEN
.
25
4.1.1.2.
KONSTRUKTION
VON
PWH1509E
.
27
4
1.1.3.
INTEGRATION
DER
XYLA-LACZ
FUSIONEN
INS
CHROMOSOM
VON
B.
MEGATERIUM
WH320
UND
WH321
.
28
4.1.1.4
REGULATION
DER
XYLA-LACZ
FUSIONEN
IN
DEN
KONSTRUIERTEN
STAEMMEN
.
30
4.1.1.5.
EINFLUSS
EINES
5'-VERLAENGERTEN
XYL
ANTEILS
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
INTEGRIERTEN
XYLA-LACZ
FUSION
.
32
4
1.2.
KONSTRUKTION
VON
SS.
MEGATERIUM
STAEMMEN
MIT
XYLA-IACZ
FUSIONEN
AM
TRPC
GENORT
.35
4
1.2.1.
KLONIERUNG
VON
INTEGRATIVEN
PLASMIDEN
MIT
XYLA-LACZ
FUSIONEN
IM
TRPC
GEN
.35
4.1.2.2.
INTEGRATION
DER
PLASMIDE
IN
SS.
MEGATERIUM
WH320
UND
WH321
.35
4.1.2
3.
REGULATION
DERXYM
EXPRESSION
IN
DEN
KONSTRUIERTEN
STAEMMEN
.
38
4.1.2.4.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
VON XYLR
IN
ANWESENHEIT
VON
GLUCOSE
.
38
4.2.
BESTIMMUNG
DER
XYLA-LACZ
EXPRESSION
WAEHREND
DIAUXISCHEM
WACHSTUM
.
39
4.2.1.
DIAUXISCHES
WACHSTUM
MIT
GLUCOSE
UND
XYLOSE
.
39
4.2.2.
EXPRESSION
VON
XYLA
WAEHREND
DIAUXISCHEM
WACHSTUM
.
40
4.3.
DER
EINFLUSS
VON
XYLR,
CCPA
UND
CRE
AUF
DIAUXISCHES
WACHSTUM
.43
4.3.1
KONSTRUKTION
DER
STAEMME
WH368
UND
WH378
.43
4.3.2.
AUSWIRKUNG
DER
INAKTIVIERUNG
EINZELNER
REGULATIONSELEMENTE
AUF
WACHSTUM
MIT
GLUCOSE
UND
XYLOSE
.
45
4.3.3.
MESSUNG
DER
GLUCOSEAUFNAHME
M
DER
CCPA
MUTANTE
WH367
.
48
4.4.
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASC
AKTIVITAET
IN
ABHAENGIGKEIT
VERSCHIEDENER
ZUCKERKONZENTRATIONEN
.
48
4.4
1.
ABHAENGIGKEIT
DER
INDUKTION
VON
DER
XYLOSEKONZENLRATION
.
48
4.4.2
ABHAENGIGKEIT
DER
GLUCOSEREPRESSION
VON
DER
GLUCOSCKONZENTRATION
.
49
4
4
3.
ABHAENGIGKEIT
DER
FRUCTOSEREPRESSION
VON
DER
FRUCTOSEKONZENTRATION
.
51
4.5.
CHARAKTERISIERUNG
DER
XY
I
REPRESSOR
XYL
OPERATOR
WECHSELWIRKUNGEN
.
51
4.5.1.
KLONIERUNG
VON
XYL
OPERATOR-TRAGENDEN
PLASMIDEN
.
51
4
5
2
DNA
RETARDATIONSEXPERIMENTE
MIT
DEN
XYL
OPERATORFRAGMENTEN
.
52
4.5.3.
IN
VITRO
INDUKTION
DURCH
XYLOSE
.
54
4.5.4
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
ZUCKER
AUF
DIE
BINDUNG
DES
XYL
REPRESSORS
AN
DIE
OPERATOREN
.
54
4.5.5.
DNASCI
FOOTPRINL
ANALYSEN
.
56
4.5
6
DMS
SCHUTZEXPERIMENTE
.
57
4
5.7
ANALYSE
VON
OPERATORMUTANTEN
.
59
4.5
8.
VERAENDERUNG
DES
ABSTANDS
ZWISCHEN
XVLAOI
UND
XYLAO:
.
63
4.6.
CHARAKTERISIERUNG
DER
XYLOSEAUFNAHME
.
65
4
6.1
ETABLIERUNG
EINES
XYLOSEAUFNAHME-MCSSSYSTCMS
.
65
4.6.2.
REGULATION
DER
XYLOSEAUFNAHME
UEBER
DEN
XYL
REPRESSOR
.
66
4.6.3.
KATABOLITREPRESSION
DER
XYLOSEAUFNAHME
.
66
4.7.
KLONIERUNG
DER
XYLOSCPCRMECASC
.
68
4.7.1.
XYLOSEAUFNAHME
IN
SS
SUBTILIS
168
.
68
4
7.2
KLONIERUNG
DES
BEREICHS
STROMABW
AERTS
VON
XYLB
.
10
4.7.3.
SEQUENZ
DER
KLONICRTEN
DNA
.
71
4.7
4.
INAKTIVIERUNG
VON
XYLT
.
73
4.7
5.
AUSWIRKUNGEN
DER
INAKTIVIERUNG
VON
XYLT
.
76
4.7.6.
NACHWEIS
DER
OPERONSTRUKTUR
VON
XYLABT
.
77
4.8.
BESTIMMUNG
KINETISCHER
PARAMETER
DER
XYLOSEAUFNAHME
.
78
4.8.1.
BESTIMMUNG
VON
K
M
UND
I
'
YY,
.
78
4.8.2.
INHIBIERUNG
DER
XYLOSEAUFNAHME
DURCH
GLUCOSE
.78
4.8.3.
BESTIMMUNG
DER
HEMMKONSTANTEN
FUER
GLUCOSE
UND
FRUCTOSE
.
79
INHALTSVERZEICHNIS
III
5.
DISKUSSION
.
82
5.1.
DIAUXISCHCS
WACHSTUM
UND
EXPRESSION
VONJ^-M
.
82
5.1.1.
VERWENDUNG
MERODIPLOIDER
B.
MEGATERIUM
STAEMME
.
82
5.1.2.
ROLLE
DER
BEKANNTEN
REGULATIONSKOMPONENTEN
BEI
DIAUXISCHEM
WACHSTUM
UND
XYLA
EXPRESSION
.
82
5.1.3.
GLUCOSEINDUKTION
BEI
FEHLENDEM
CRE
.
84
5.1.4.
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
DER
INDUKTION
UND
KATABOLITREPRESSION
.
84
5.2.
XYL
REPRESSOR
XYL
OPERATOR
WECHSELWIRKUNGEN
.
85
5.2.1.
KOMPLEXE
STRUKTUR
VON
XYLAOI
.
86
5.2.2.
XYLAOI
UND
DNA
LOOPING
.
87
5.2.3.
XYL
OPERATOREN
IN
VERSCHIEDENEN
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
.
90
5.2.4.
BETEILIGUNG
VON
XYLR
AN
DER
KATABOLITREPRESSION
.
91
5.3.
XYLOSEAUFNAHME
.
94
5.3.1.
XYLOSEAUFNAHME
IN
B.
SUBLILIS
168
.
94
5.3.2.
SEQUENZANALYSE
VON
XYLT.
.
95
5.3
3
XYLT
GEHOERT
ZUR
FAMILIE
2
DER
'
MAJOR
FACILITATOR
SUPERFAMILY'
.
96
5.3.4.
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
XYLOSEAUFNAHMESYSTEMEN
.
98
5.3
5.
XYLT
LIEGT
IN
EINEM
OPERON
MIT
XYLAB
.
100
5.3.6.
AKTIVITAET
DER
VON
XYLT
CODIERTEN
XYLOSEPERMEASE
.
100
5
3.7.
GLUCOSEKOMPETITION
DER
XYLOSEAUFNAHME
.
101
5.3.8
INDUKTORAUSSCHLUSS
UND
INDUKTORAUSSCHLEUSUNG
.
102
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
103 |
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